2016 Fiscal Year Annual Research Report
Enzymatic synthesis of useful hydroxyproline derivatives by regio- and stereo-selective hydroxylation
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15K18677
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
原 良太郎 早稲田大学, 理工学術院総合研究所(理工学研究所), 次席研究員(研究院講師) (70553535)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒドロキシプロリン / trans-3-ヒドロキシ-L-プロリン / ヒドロキシエクトイン / アミノ酸水酸化酵素 / エクトイン水酸化酵素 / 2-オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，遊離アミノ酸に対し位置・立体選択的にヒドロキシ基を導入可能な水酸化酵素，特に2-オキソグルタル酸依存型水酸化酵素を利用することにより，ヒドロキシプロリンおよびその類縁体の効率的合成プロセスを開発する。
本年度は，前年度までに取得した放線菌Streptomyces cattleya由来2-オキソグルタル酸依存型エクトイン水酸化酵素の基質特異性，ならびに当該酵素遺伝子発現大腸菌を菌体触媒とした微生物変換反応を実施した。
ヒドロキシプロリン類縁化合物合成に向け，組換え大腸菌におけるエクトイン水酸化酵素の高発現系を確立し，精製酵素を調製可能とした。精製酵素系における至適条件下でプロリン類縁体に対する水酸化活性を評価した結果，デヒドロプロリン，メチルプロリン，ピペコリン酸に対する水酸化活性があることを初めて明らかにした。
また，trans-3-ヒドロキシプロリンの効率的合成に向けたプロセス開発を行った。様々な反応系を検討したところ，大腸菌JM109を菌体触媒としたときが最もtrans-3-ヒドロキシプロリンの生産性が高かったため，本反応系において詳細な検討を行った。
ジャーファーメンターを用いて，水酸化酵素の生産量が最も高くなる培養条件を見出し，高活性な菌体触媒を得た。さらに，当該菌体を用いて反応条件の最適化を図ったところ，プロリンを効率的に水酸化し，trans-3-ヒドロキシプロリンを選択的に合成することを可能とした。
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