2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒストン脱メチル化酵素Kdm5aの造精機能における作用機序の解明
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15K20101
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西尾 英紀 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10621063)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | KDM5A / 停留精巣 / ヒストン脱メチル化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【精子幹細胞の培養細胞系の確立】in vitroでのKdm5aの発現機能解析のために、まず精子幹細胞の培養細胞系の確立を計画したが、予定通りに進まなかったため、市販の培養細胞を用いた以下の機能解析を平行して行った。
【遺伝子導入を用いたKdm5aの機能解析】精巣の構成細胞である、精原細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞の市販されている培養細胞を用いてKdm5aの機能解析を行った。具体的には、精原細胞の培養株であるGC-1細胞、セルトリ細胞の培養株であるTM4細胞、ライディッヒ細胞の培養株であるTM3細胞に、Kdm5aをトランスフェクションし、それぞれの細胞での精子形成に関わる遺伝子発現について、定量RT-PCR、Western Blottingにて検討した。またヒストンH3K4のメチル化の状態をWestern Blottingにて評価した。
【クロマチン免疫沈降法を用いたヒストン修飾領域の同定】ゲノム上のヒストン修飾状態を解析するため、DNAとヒストンをクロスリンクさせ、クロマチンを超音波で断片化した後、H3、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3の抗体で免疫沈降を行った。引き続き、沈降させたDNA-ヒストン複合体からDNAを抽出し、目的とする遺伝子特異的プライマーでPCR反応を行い、ヒストン修飾状態を定量化する。またChIP法で得られたDNAをプロモーターアレイにハイブリダイズすることで、ゲノム上にヒストン修飾をマッピングを行い、停留精巣におけるKdm5a応答遺伝子の同定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
精子幹細胞の培養細胞系の確立について、ラット精巣組織を摘出し、機械的処理により細胞を分散させ、ソーティングによる精子幹細胞である精原細胞を回収するものの、その後の培養の条件設定中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、精子幹細胞の培養細胞系の確立を計画しつつ、クロマチン免疫沈降法を用いたヒストン修飾領域の同定をすすめ、停留精巣におけるKdm5a応答遺伝子の同定を行う。またKdm5a応答遺伝子のノックアウトマウスの作製を行い、その精巣組織の評価を行う。
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