エンドサイトーシスと外来因子取込を制御する細胞内シグナル伝達マシナリー（国際共同研究強化）

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15KK0290
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 大場 雄介 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30333503)
• Project Period (FY): 2016 – 2018
• Keywords: 蛍光イメージング / シグナル伝達 / エンドサイトーシス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は複数のオルガネラ間での局在のダイナミックな変化を、蛍光バイオイメージングにより解析し、新しいオルガネラダイナミクスの制御機構を解明することを目的に行っている。まず、生化学的にPI3Kとの結合が確認された4因子について、ノックダウン細胞におけるエンドサイトーシス能を評価し、3因子はエンドサイトーシスの正の制御因子、1因子は負の制御因子であることが判明した。次にこれらの因子について、蛍光タンパク質を融合したコンストラクトを作製し、生細胞観察によりその局在を観察した。細胞内小器官は同じく蛍光タンパク質を用 いたオルガネラマーカーを用いて可視化した。ひとつの因子については、蛍光タンパク質を付加したコンストラクトは、既報のあるいは我々の手で実施した免疫蛍光染色による内在性タンパク質の局在と大きく異る問題点が浮上した。この因子の場合には、spilitGFP技術を応用することで本来の局在を示すコンストラクトを作製することで問題を解決した。結果として4因子のうち、2つはミトコンドリアに、1つは細胞質に、もう1つは細胞膜に局在することが明らかになった。
上記の結果を受けてエンドソームとミトコンドリアの位置関係を定量的に解析したところ、両者は一定の確率で接触することがわかった。この接触は増殖因子刺激等で亢進する。さらにミトコンドリア局在因子のノックダウン細胞において両者の接触を定量解析したところ、正の制御因子のノックダウンで接触が抑制され、負の制御因子のノックダウンで亢進した。この結果から、エンドソームの成熟過程において、ミトコンドリアとの相互作用は何らかの意義を有しており、この相互作用にPI3Kと当該因子の結合が関与するものと考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね調書記載の計画通りの進捗であるため。

Strategy for Future Research Activity

本年度に見出された上記因子群によるエンドサイトーシスの制御機構を分子レベルで明らかにする。特に、各種刺激によって細胞を刺激した際に生じる制御因子の局在の変化や、小器官自身のダイナミックな変化を詳細に解析する。そのために国際共同研究による新規技術の導入を行う。
また、各因子間、あるいは現象間の関係性を紐解くため、観察事象のモデル化を行い、エンドサイトーシスやオルガネラ制御機構を統合的に理解する。

Research Products

• [Journal Article] Rab5-regulated endocytosis plays a crucial role in apical extrusion of transformed cells. (2017)
  • Author(s): S. Saitoh, T. Maruyama, Y. Yako, M. Kajita, Y. Fujioka, Y. Ohba, N. Kasai, N. Sugama, S. Kon, S. Ishikawa, T. Hayashi, T. Yamazaki, M. Tada and Y. Fujita.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Volume: 114 Pages: E2327-E2336
  • DOI: 10.1073/pnas.1602349114
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improved FRET biosensor for the measurement of BCR-ABL activity in chronic myeloid leukemia cells. (2017)
  • Author(s): M. Horiguchi, M. Fujioka, T. Kondo, Y. Fujioka, X. Li, K. Horiuchi, A.O. Satoh, P. Nepal, S. Nishide, A. Nanbo, T. Teshima and Y. Ohba.
  • Journal Title: Cell. Struct. Funct. Volume: 42 Pages: 15-26
  • DOI: doi.org/10.1247/csf.16019
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A leukemogenic kinase, FIP1L1-PDGFRA, and a SUMO E3 ligase, PIAS1, form a positive crosstalk via their enzymatic activities. (2017)
  • Author(s): M. Ibata, J. Iwasaki, Y. Fujioka, K. Nakagawa, S. Darmanin, M. Onozawa, D. Hashimoto, Y. Ohba, S. Hatakeyama, T. Teshima and T. Kondo.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 108 Pages: 200-207
  • DOI: 10.1111/cas.13129
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Epstein-Barr virus exploits host endocytic machinery for cell-to-cell viral transmission rather than a virological synapse. (2016)
  • Author(s): A. Nanbo, K. Kachi, H. Yoshiyama and Y. Ohba.
  • Journal Title: J. Gen. Virol. Volume: 97 Pages: 2989-3006
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000605.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumour endothelial cells in high metastatic tumours promote metastasis via epigenetic dysregulation of biglycan. (2016)
  • Author(s): N. Maishi, Y. Ohba, K. Akiyama, N. Ohga, J.I. Hamada, H. Nagao-Kitamoto, M. Alam, K. Yamamoto, T. Kawamoto, N. Inoue, A. Taketomi, M. Shindoh, Y. Hida and K. Hida.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 28039
  • DOI: 10.1038/srep28039
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lypd8 promotes the segregation of flagellated microbiota and colonic epithelia. (2016)
  • Author(s): R. Okumura, T. Kurakawa, T. Nakano, H. Kayama, M. Kinoshita, D. Motooka, K. Gotoh, T. Kimura, N. Kamiyama, T. Kusu, Y. Ueda, H. Wu, H. Iijima, S. Barman, H. Osawa, H. Matsuno, J. Nishimura, Y. Ohba, S. Nakamura, T. Iida, M. Yamamoto, E. Umemoto, K. Sano and K. Takeda.
  • Journal Title: Nature Volume: 532 Pages: 117-121
  • DOI: 10.1038/nature17406
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Receptor activator of NF-κB ligand induces cell adhesion and integrin α2 expression via NF-κB in head and neck cancers. (2016)
  • Author(s): T. Yamada, M. Tsuda, T. Wagatsuma, Y. Fujioka, M. Fujioka, A.O. Satoh, K. Horiuchi, S. Nishide, A. Nanbo, Y. Totsuka, H. Haga, S. Tanaka, M. Shindoh and Y. Ohba.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 23545
  • DOI: 10.1038/srep23545
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase C. (2016)
  • Author(s): T. Inuzuka, Y. Fujioka, M. Tsuda, M. Fujioka, A.O. Satoh, K. Horiuchi, S. Nishide, A. Nanbo, S. Tanaka and Y. Ohba.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 21613
  • DOI: 10.1038/srep21613
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A role of the sphingosine-1-phosphate (S1P)-S1P receptor 2 pathway in Epithelial Defense Against Cancer (EDAC). (2016)
  • Author(s): S. Yamamoto, Y. Yako, Y. Fujioka, M. Kajita, T. Kameyama, S. Kon, S. Ishikawa, Y. Ohba, Y. Ohno, A. Kihara and Y. Fujita.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 27 Pages: 491-499
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-03-0161
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 蛍光イメージングを用いた細胞内シグナル伝達によるエンドサイトーシスの制御機構の解析 (2017)
  • Author(s): 大場雄介、藤岡容一朗、田端和仁、西出真也、南保明日香、野地博行
  • Organizer: 第122回解剖学会
  • Place of Presentation: 長崎大学坂本キャンパス（長崎県・長崎市）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
  • Invited
• [Presentation] 蛍光イメージングで紐解くインフルエンザウイルス感染の分子基盤 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介、藤岡 容一朗、西出 真也、南保 明日香
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(茨城県・つくば市)
  • Year and Date: 2016-11-25 – 2016-11-27
  • Invited
• [Presentation] 慢性骨髄性白血病分子標的治療薬薬効評価のためのFRETバイオセンサーの開発と改良 (2016)
  • Author(s): 大場雄介、近藤健、豊嶋崇徳
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] 生きた白血病細胞でBCR-ABL活性を精密測定するめのFRETバイオセンサーの改良 (2016)
  • Author(s): 大場雄介、藤岡真理、堀口美香、近藤健、豊嶋崇徳
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] インフルエンザウイルス粒子の取り込みを制御するシグナル伝達機構 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介
  • Organizer: 第6回北海道探索病理学研究シンポジウム
  • Place of Presentation: ニューオータニイン札幌 （北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-09-17 – 2016-09-17
  • Invited
• [Presentation] ライブセル蛍光イメージングの口腔疾患予防への応用 (2016)
  • Author(s): 西出 真也、藤岡 容一朗、堀内 浩水、堀口 美香、佐藤 絢、 Prabha Nepal、王 セイ、南保 明日香、大場 雄介
  • Organizer: 第58回歯科基礎医学会学術大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-08-24 – 2016-08-26
• [Book] SH2 domain-based FRET biosensor for measuring BCR-ABL activity in living CML cells. (2017)
  • Author(s): Fujioka M, Asano Y, Nakada S and Ohba Y.
  • Total Pages: 22
  • Publisher: Springer