2015 Fiscal Year Research-status Report
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15KT0153
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏明 中央大学, 理工学部, 教授 (20372427)
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2015-07-10 – 2018-03-31
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| Keywords | 人工細胞 / ゲノム増幅 / 分裂 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子・細胞生物学における膨大な研究の蓄積の結果，現代の細胞生物学では，多様な特殊化したタンパク質が複雑巧妙かつシームレスに働き，代謝や細胞分裂など細胞の主要なタスクが達成されるという見方が主流である．しかし，細胞の「進化」を考えると，地球上に細胞が出現した当初からこのような複雑な機構を持ち得たとは考えにくい．本申請では，DNAの等温増幅と膜の成長・分裂が協同して進行し，膜と核酸のみから構成される原始的な細胞モデルでも増殖可能であることを実験的に示すことを目的とした．
具体的には，リン脂質でできた巨大ベシクル（直径5-10マイクロメートル）に大腸菌またはファージから抽出した巨大DNAとphi29 DNAポリメラーゼを封入する．phi29酵素により，ベシクル内でDNAの増幅反応が進み，それがベシクル膜の分裂変形を誘発するという仮説を実験的に検証する．2015年度は，酵素やDNAをベシクル内に封入するための条件検討，分裂変形および変形後の娘ベシクルを完全分離する条件検討，また，試験管内においてphi29酵素によるDNA等温増幅反応のダイナミクスの検証を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度である2015年度は，半年程度の研究期間であったが，当初の計画以上の進捗があった．まず，DNAや酵素を内封した巨大ベシクルを作製し，それが分裂変形するために必要な基礎的条件を検討した．顕微鏡下において，ベシクルの懸濁液に高濃度糖溶液を加えて浸透圧ショックを与えると，ベシクル内の水が漏出し，体積が減少することで様々な形状を呈する．このとき，ベシクル内に細胞質成分を模擬した生体高分子が高濃度（重量濃度で数%以上）存在すると，ダンベル形状やパールチェーン形状といった分裂様形状が支配的になることを確認した．本研究の最終目標は，ベシクル内で増幅したDNAが分裂様変形を促進するという仮説の検証であるため，DNAが増幅しなければ分裂様変形が起こらない，という下限の生体高分子濃度を決定した．次に，DNAの等温増幅反応については，市販の酵素やNTP，バッファ類およびランダムプライマーを組み合わせ，テンプレートのDNAが3時間以内に1000倍程度まで増幅する反応条件をほぼ確立した．全ての試薬をプレミックスした状態で販売されているワンポットDNA増幅試薬では問題なく増幅反応が進行するが，この反応は1反応(20マイクロリットル)当たりのコストが非常に高価（3000円／1反応程度）であったため，少なくとも数百マイクロリットルが必要なベシクル実験には適用が困難である．そこで，カスタムでの試薬配分を試し，市販の試薬と同等の性能を1/100以下のコストで達成するに至った．
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| Strategy for Future Research Activity |
2016年度は，ベシクル内に上記のDNA等温増幅反応試薬を封入し，その中で反応が進行する条件の確率を目指す．ベシクル内での生化学反応において常に問題となるのが，小分子成分（イオン類，NPTなど）の漏出である．酵素やDNAといった巨大分子はベシクル内に封入後漏出しないが，小分子は漏出するので，基本的にベシクル外側のバルク水溶液にも同成分を入れておく必要がある．2015年度に，各試薬成分をカスタムで組み合わせてゲノム増幅反応を行うための条件を確立したため，このバルク溶液も自前で調整できる．ベシクル内でDNA等温増幅反応を行い，その進行過程をSYBR Greenの傾向顕微鏡観察によりモニターする．
その後，こちらも2015年度に確立した，バックグラウンド高分子による分裂変形の臨界条件と組み合わせ，DNAの増幅反応の有無に依存した分裂変形の条件を詳細に調べる．
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| Causes of Carryover |
研究を推進するための研究補助員を募集したところ，予想以上に高い実験技能を持った方（そのため時給額も引き上げた）を雇用することができたため，2年目以降にこの人材を確保するための額を繰り越すことにした．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験補助者を年間（条件が合えば3年目も）雇用する（年間100万円程度）
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