2008 Fiscal Year Annual Research Report
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16087207
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
難波 啓一 Osaka University, 大学院・生命機能研究科, 教授 (30346142)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 准教授 (40346143)
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| Keywords | 1分子計測(SMD) / 電子顕微鏡 / ナノバイオ / ナノマシン / 分子モーター |
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| Research Abstract |
我々のグループは、極低温電子顕微鏡による超分子立体構造解析の技術開発と、超分子を構成する各分子のX線結晶解析と電子線解析との相補的連携技術の開発を目指し、多面的な研究を進めている。
<電子顕微鏡解析の高分解能化を目指す技術開発>
電子顕微鏡による解析では、画像解析法の改良と共に、急速凍結氷包埋試料の厚さをできるだけ薄くすることにより蛋白質複合体粒子像のコントラストを上げ、同時に電子線照射損傷限界まで電子線照射量を増やしてS/N比を上げることが高分解能解析の鍵となる。エネルギー分光型極低温電子顕微鏡(日本電子JEM-3200SFC)を用い、細菌べん毛のポリロッド、ポリフック、病原性細菌の病原性因子分泌装置ニードル複合体、TMVなどを試料として、試料調整法や撮影条件の最適化を進めて3次元再構成像を高分解能化し、上記すべての試料で6.5A〜9A分解能の3次元密度分布図を得て、αヘリックス、βシート、βヘアピンなど2次構造の可視化に成功した。しかも、画像データ収集に1〜2日、画像解析に3日程度と、以前は1〜2年かかっていた作業を1週間以内に完了させることが可能になり、電子顕微鏡による立体構造解析の大幅な高速化と効率化を達成した。今後はさらに高分解能解析の工夫を行い、原子レベルの分解能の達成を目指す。また、L型フィラメントの立体構造については従来のらせん対称性を利用した解析法による構造解析をほぼ完了し、多型変換機構にさらなる手掛かりを得た。
<X線構造解析と電子顕微鏡解析の相補的連携を目指す研究>
べん毛の部分構造についてはX線結晶解析を続けており、べん毛蛋白質輸送に関わるFliJがF-ATPaseのγサブユニットにそっくりな立体構造を持つこと、ロッドキャップFlgJのmuramidase機能のメカニズム、シャペロンFliTの各ドメインの役割など、興味深いしくみが明らになりつつある。べん毛モーター固定子プロトンチャネルを構成するMotBのペリプラズミックドメインの結晶構造を基盤とした固定子変異体の機能解析から、固定子がモーターに組み込まれプロトンチャネルとして活性化するしくみも解明。また、分子動力学シミュレーション法の応用として開発されたフレキシブルフィッティング法を用いることにより、電子顕微鏡解析により得た3次元密度マップへのX線結晶構造モデルのドッキングが以前より高精度で行えるようになり、べん毛各部の超分子構造の精度が向上した。
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