有機塩素系農薬を30年間連用した畑土壌からの新規脱塩素遺伝子・酵素群の単離

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16380047
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 妹尾 啓史 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 教授 (40206652)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大塚 重人 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 講師 (10313074)
• Keywords: 土壌 / 農薬長期連用圃場 / γ-HCH / IS6100 / 石油成分 / ジオキシゲナーゼ / 土壌微生物 / 生態系修復

Research Abstract

1.可動性遺伝因子IS6100に挟まれた遺伝子の取得
有機塩素系農薬長期連用圃場のγ-HCH連用区土壌から過去に分離されたγ-HCH分解菌Sphingobiumが保有するγ-HCH分解酵素遺伝子のいくつかは、可動性遺伝因子IS6100によって他の微生物から水平伝達されてきたことが示唆されている。そこで、この試験圃場の土壌から抽出した土壌DNAを鋳型とし、IS6100の配列から設計したプライマーを用いてPCR反応を行い、この可動性遺伝因子に挟まれた遺伝子を取得することを試みた。
対照区土壌、堆肥区土壌、HCH区土壌について、γ-HCH添加または無添加条件でインキュベートし、土壌DNAを抽出してPCRを行った。γ-HCHを添加した堆肥区土壌由来の土壌DNAから明確なPCR増幅産物が得られた。これをクローニングしてシーケンスしたところ、γ-HCH分解酵素遺伝子の一つであるlinBがIS6100に挟まれていることが分かり、その配列には多様性が見られた。
2.石油成分分解系遺伝子の多様性解析
農薬長期連用圃場の堆肥区、TPN・堆肥区、TPN・HCH・堆肥区土壌に石油成分であるナフタレン・フルオレン・石油エーテルを添加してインキュベートした。インキュベート前、後の土壌からDNAを抽出し、ナフタレン分解系酵素遺伝子群を標的として設計したプライマーを用いてPCRを行った。プライマーセットの1つBPDOXにより増幅産物が得られ、これをクローニング、シーケンスした。
その結果、全ての土壌からジオキシゲナーゼ遺伝子のものと思われるクローンが得られた。既知のジオキシゲナーゼ遺伝子とほぼ100%の相同性を示すクローンが得られた一方、相同性が低い多様なクローンがインキュベート後の土壌から得られ、新規なジオキシゲナーゼが数多く存在することが示された。