2006 Fiscal Year Annual Research Report

ジグリコシダーゼの触媒機構の解明から植物β-グルコシダーゼの分子進化をたどる

Research Project

Project/Area Number	16380079
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	坂田完三京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平竹潤京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075) 水谷正治京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898) 清水文一京都大学, 化学研究所, 助手 (50324695) 加藤博章京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
Keywords	ジグリコシダーゼ / β-プリメベロシダーゼ / ファミリー1 グリコシダーゼ / 進化系統樹解析 / X線結晶構造解析 / β-プリメベロシルアミジン / ビシアニンヒドロラーゼ
Research Abstract	(1)ジグリコシダーゼの基質認識と触媒機能の解明 (1)-a チャ葉β-プリメベロシダーゼのX線結晶構造解析昨年度達成した阻害剤のβ-プリメベロシルアミジンを結合した状態での2.5Åの分解能に加えて、本年度はさらに結晶化条件の最適化を行ない1.8Åの分解能で解析することができた。その結果、二糖に直接相互作用するアミノ酸残基の同定、活性ポケット開口部の構造の詳細を明らかにし,本酵素の二糖認識機構の詳細を明らかにした。 (1)-b 6'-位修飾擬似二糖配糖体を用いた基質認識機構の解明 p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNP Glc)の6'-位の水酸基をS原子で置換してキシロースや種々のアルコール(C_<2-4>)を結合した擬似二糖配糖体を合成し、ジグリコシダーゼの1つのビシアニンヒドロラーゼに対して加水分解活性を調べた。本酵素はpNP β-primeveroside (pNP Pri)に対して、高い加水分解活性を示す。しかしS原子で置換したpNP PriやpNP Glcはほとんど加水分解しない。直鎖C_3アルコールを結合した配糖体に高い加水分解活性が観察された。直鎖アルコールが二糖を認識するアミノ酸残基と相互作用しているものと考えられる。 (2)植物界におけるジグリコシダーゼの分布・分子進化の解析ジグリコシダーゼのアミノ酸配列を元に進化系統樹解析を行ったところ、ジグリコシダーゼはそれぞれ別のβ-グルコシダーゼから並行進化していた。さらにpNP Priを用いて、無作為に選んだ18種の植物について二糖加水分解活性を調べたところ、7種もの植物に活性が見られた。以上の結果は、β-プリメベロシダーゼと類似した酵素活性を示すジグリコシダーゼが、植物界には相当数分布していることを強く示唆している。