2004 Fiscal Year Annual Research Report
Intravital Cell Imaging法の開発と脳科学への応用-Single Cellの知見のin situでの検証-
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16390407
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
山本 清二 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教授 (60144094)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺川 進 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246)
櫻井 孝司 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362)
塚田 秀夫 浜松ホトニクス, 中央研究所, 主任部員
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| Keywords | 共焦点レーザー顕微鏡 / 蛍光蛋白 / 生体内細胞イメージング / 蛍光色素 / イメージングファイバー / 脳虚血 |
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| Research Abstract |
【目的】蛍光色素・蛍光蛋白(fluorescent protein)による標識法の発達と、共焦点顕微鏡・全反射型蛍光顕微鏡など顕微鏡による観察法の発展により、培養細胞レベルでの詳細な細胞内信号伝達の解析が可能となったが、未だに培養細胞と個体レベルの差は大きい。本研究では、個体レベルでの詳細な細胞内・細胞間信号伝達を解析するために"Intravita Cell Imaging法"を開発することを試みた。
【方法および結果】脳の標識方法としては、脳へのin situ lipofection法による蛍光蛋白発現法と蛍光色素投与法の開発、観察方法としては、共焦点蛍光顕微鏡とファイバー共焦点顕微鏡による蛍光観察法の開発を目標とした。共焦点Unit(CSU21,Yokogawa)を装着した正立顕微鏡、(BX50WI, Olympus)により観察し、Image IntensifierおよびCCD Cameraにより共焦点蛍光画像を取得し解析した。ラット(300g、オス)に慢性脳室カニュラを設置し、Plasmid DNA(50μg/kg)をLiposomeと共に脳室内に1回投与後2日目に観察すると、両側の大脳皮質・基底核・海馬に観察可能な発現が見られた。また、全麻下にラットの頭蓋骨にcranial windowを設け、硬膜外からカルシウム指示薬であるCalcium Orange(1mMx1h)を投与、硬膜外にカバーガラスを固定し共焦点顕微鏡で観察すると、10分間の前脳虚血を顕微鏡観察下に負荷し、脳表カルシウムイオン濃度の持続的上昇が観察可能であった。
【まとめ】硬膜外からの蛍光色素投与、脳室内へのPlasmid DNA投与により、生きているラットで脳表からの共焦点蛍光像の観察が可能になった。今後の問題点として:1)標識法については蛍光色素の神経細胞へのより選択的な投与および深部脳組織への投与を可能にすること;2)観察法については脳深部の共焦点観察を可能にすることである。
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