内耳有毛細胞に存在する機械電気変換イオンチャンネルの単離と機能解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390490
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 鵜川 眞也 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (20326135)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 島田 昌一 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (20216063) ; 藤森 修 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (30128350) ; 平林 義章 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (30181184) ; 村上 信五 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (80157750)
• Keywords: MET channel / TRP / OTRPC4 / ASIC / 有毛細胞 / 内耳 / Western blot / 免疫組織化学

Research Abstract

マウス内耳有毛細胞cDNAライブラリーを作製し、TRPファミリーおよびASICファミリーと相同性を示す遺伝子を徹底的にスクリーニングしたところ、17個の遺伝子断片が単離できた。Saquence解析から、TRPファミリーに属するものが2種(ANKTM1とOTRPC4)、ASICファミリーに属するものが3種(ASIC1a、ASIC1b、ASIC3)含まれていることがわかった。In situ hybridization法にて有毛細胞におけるメッセンジャーRNAの発現を確認したところ、TRPファミリーに属するOTRPC4が内有毛細胞および外有毛細胞に発現していることが確認できた。この遺伝子は浸透圧刺激により活性化されることから、メカノレセプターとして機能している可能性が高い。そこでさらに詳細な分布をタンパクレベルで検討するため、OTRPC4の部分タンパクをバキュロウイルス発現系にて発現させ、これをウサギに免疫することで抗血清を得た。この抗血清をふたたび発現させたOTRPC4の部分ペプチドを用いて精製し、精製抗体を得た。Western blot法にて検討したところ、得られた抗体はOTRPC4と特異的に反応することがわかった。現在、内耳から抽出した膜タンパク分画を用いてWestern blot解析を行っているところである。同時に、surface preparation法にて単離した内耳を使って有毛細胞におけるタンパクレベルでのOTRPC4の局在を調べているところである。