破骨細胞の骨吸収能を制御するRANKLシグナルとSHP-1の機能解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390530
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 青木 和広 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助手 (40272603)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 春宮 覚 東京医科歯科大学, 歯学部, 教務職員 (50301792) ; 下川 仁彌太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教授 (80014257) ; 中川 敦史 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20188890) ; 石黒 正路 (財)サントリー生物有機科学研究所, 部長研究員 (10280687)
• Keywords: SHP-1 / 破骨細胞 / アゴニスト設計 / 質量分析 / 骨吸収能

Research Abstract

チロシンのリン酸化は、シグナル伝達において重要な役割を担う。説リン酸化酵素であるSHP-1の酵素活性低下は破骨細胞機能すなわち骨吸収能の著しい上昇をきたらす。このことはSHP-1が破骨細胞機能発現において負の制御を司っていることを示唆する。我々はSHP-1の結合タンパクを同定することにより、その結合タンパクとの相互作用を強めるアゴニスト設計により破骨細胞機能を抑制する薬剤の開発を行おうと計画した。ところが、昨年の報告にも示したが破骨細胞に分化するRAW264.7細胞株にSHP-1の導入しようとしても全く入らなかったため、まず、293T細胞を用いてトランスフェクションを試みた。用いたvectorはpEFIIIであり、導入したはフラッグタグつきのSHP-1をコードする遺伝子と脱リン酸化酵素機能を失活させるミューテイションを入れたSHP-1(C453S)を導入したところSHP-1特異的な結合を示すバンドをSDS-PAGE上で見い出した。そのバンドを切り出し、MALDI-TOFを用いた質量分析装置にかけたところSHP-1に結合するタンパク質を同定できた。(KRT19などいくつかとれてきた)同定されたSHP-1結合タンパクが破骨細胞機能発現において重要なタンパクであるか否かを調べるために、RAW264.7細胞の細胞抽出液とpGEX-2T vectorを用いてバクテリアに導入して精製したSHP-1とGSTとの融合タンパクによりGSTプルダウンアッセイを行った。すると、2つSH2domainを欠いたものなどを用いてSHP-1特異的に結合するタンパクを同定した。なお、この結果は特許申請するために公表を差し控えてください(別紙参照)。

Research Products

• [Journal Article] A TNF-_□ antagonist inhibits inflammatory bone resorption induced by Porphyromonas gingivbalis infection in mice. (2006)
  • Author(s): Suzuki Y, Aoki K, Saito H, Umeda M, Nitta H, Baron R, Ohya K
  • Journal Title: Journal of Periodontal Research 41 Pages: 81-91
• [Journal Article] Regional distinctions in cortical bone mineral density measured by pQCT can predict alterations in material property at the tibial diaphysis of the Cynomolgus monkey. (2006)
  • Author(s): Kiichi Nonaka, Satoshi Fukuda, Kazuhiro Aoki, Takashi Yoshida, Keiichi Ohya
  • Journal Title: Bone 38 Pages: 265-272
• [Journal Article] Subcutaneous Injections of a TNF-_□ Antagonistic Peptide Inhibit Both Inflammation and Bone Resorption in Collagen-Induced Murine Arthritis. (2005)
  • Author(s): T.Kojima, K.Aoki, K.Nonaka, H.Saito, M.Azuma, H.Iwai, B.J.BVarghese, H.Yoshimasu, R.Baron, K.Ohya, T.Amagasa
  • Journal Title: Journal of Dental and Medical Sciences 52(1) Pages: 91-99
• [Journal Article] Inhibition of RANKL-induced Osteoclastogenesis by (-)-DHMEQ, a Novel NF-kB Inhibitor, Through Downregulation of NFATcl. (2005)
  • Author(s): H.Takatsuna, M.Asagiri, T.Kubota, Ko.Oka, T.Osada, C.Sugiyama, H.Saito, K.Aoki, K.Ohya, H.Takayanagi, K.Umezawa
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Research 20(4) Pages: 653-662
• [Journal Article] RANKL/RANKシグナル伝達阻害剤. (2005)
  • Author(s): 青木和広, 大谷啓一
  • Journal Title: 日本臨床 63(9) Pages: 1620-1626
• [Journal Article] Effectiveness of Extracted-teeth as Bone Substitute : Application to Parietal Bone Defects in Rabbits.
  • Author(s): K.Tint, H.Kondo, S.Kuroda, T.Fujimoro, K.Aoki, K.Ohya, S.Kasugai
  • Journal Title: Journal of Oral Tissue Engineering (In Press)
• [Journal Article] Bovine deciduous dentine is more susceptible to osteoclasic resorption than permanent dentine : results from quantitative analyses.
  • Author(s): Varghese BJ, Aoki K, Shimokawa H, Ohya K, Takagi Y
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Metabolism (In Press)
• [Journal Article] A Peptice Mimicking a TNF Receptor Loop Blocks RANKL-induced Signaling, Bone Resorption and Bone Loss.
  • Author(s): K.Aoki, H.Saito, C.Itzstein, M.Ishiguro et al.
  • Journal Title: Journal of Clinical Investigation (In Press)