蛍光タンパク質を利用した分子センサーの開発とイノシトール燐脂質系のダイナミクス

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390532
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (70217149)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 東城 庸介 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731) ; 森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (20326549)
• Keywords: イノシトール三リン酸 / 蛍光プローブ / FRET / イメージング / IP3受容体 / calcium

Research Abstract

1、改良型LIBRAの作成
FRETの蛍光ドナーであるECFPをより蛍光強度が強く、蛍光波長特性の優れたceruleanに置換した。さらにceruleanとリガンド結合ドメインをつなぐリンカーの長さを調節することによって蛍光変化率が約50%向上した。このリンカーをラットtype2 IP3受容体のリガンド結合ドメインを使った改良型LIBRAに導入し、さらにそのリガンド結合ドメインと蛍光アクセプターであるVenusの間のリンカーを最適化した。その結果、プロトタイプの約3倍の蛍光変化率を持つ改良型LIBRAの作成に成功した。
2、唾液腺細胞へのLIBRAの導入
数種類のリポフェクション試薬と導入方法を用いて、分離耳下腺細胞への遺伝子導入効率を比較した。その結果Lipofectamine2000とoptiMEMを用た方法で最も高い遺伝子導入効率が得られた。ただし、遺伝子発現までの間に唾液腺細胞の形態が大きく変化することから、唾液腺機能の一部が失われる可能性が懸念された。そこで分子センサーを精製し、マイクロインジェクションによって唾液腺細胞に導入する方法の検討が必要があると考えられた。そこで、分子センサーを精製するためのヒスチジン・タグをコードする遺伝子配列を上記の改良型LIBRAに挿入した。
3、IP3反応のイメージング
改良型LIBRAを培養細胞に導入し、カルシウムオシレーションに伴う細胞内IP3濃度の変化を解析した。その結果、IP3の振動が起こらない場合でもカルシウムオシレーションが起こることが明らかになった。
4、今後の展開
蛍光タンパク質にcpVenusおよびcpSECFPを用いて、蛍光変化率を更に向上させ、Ca2+ウェーブに伴うIP3動態を明らかにする。