神経回路形成のキー分子であるG蛋白質の活性化イメージングによる立体的解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16500242
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 中村 岳史 大阪大学, 微生物病研究所, 講師 (60362604)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒川 量雄 (独)理化学研究所, 中野生体膜研究室, 研究員 (40333504)
• Keywords: 海馬神経細胞 / Rho / 神経細胞 / FRETプローブ / PI3キナーゼ

Research Abstract

マウス海馬神経細胞の後シナプス構造体であるスパインにおけるRhoファミリー(RhoA/Rac1/Cdc42)についてFRETプローブ分子を用いて活性化イメージングを行った。アデノウイルスベクターを開発し、マウス海馬神経細胞にFRETプローブの導入を行った。その結果、RhoA、Rac1、Cdc42いずれもスパイン上で局所的に活性化していることが見出された。スパインの形状が記憶や学習に密接に関与することが近年明らかになってきており、これらの結果はRhoファミリーがスパインの形態を制御することで記憶や学習に関与していることを示唆している。
一方、神経突起先端部での「PI3キナーゼ・GEF・Rac/Cdc42」のポジティブフィードバック制御について、PC12細胞を用いてさらに研究を進めた。FRETプローブと様々な阻害剤を組合せた実験結果を基に、GENESIS/Kinetikitプログラム上でシグナル伝達経路をモデル化し、シミュレーションによる解析を行った。その結果、PI3ホスファターゼとPI5ホスファターゼがPIP3の量の維持に重要な働きをしていることが予測された。そこで次にRNAi法を用いてPI3ホスファターゼであるPTENとPI5ホスファターゼであるSHIP2のノックダウンしたところ、NGF刺激におけるRac1とCdc42の活性化、及びPIP3の蓄積が著しく亢進すること、また神経突起の異常形成が観察された。これらのことから、Rac1とCdc42の時空間的な活性制御とそれに伴う神経突起の形成において、PIP3のホスファターゼであるPTENとSHIP2が重要な役割を果たしていることが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. (2006)
  • Author(s): Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M.
  • Journal Title: Cancer Sci. 97 Pages: 8-15
• [Journal Article] Dynamics of the RAS/ERK map kinase cascade as monitored by fluorescence probes. (2006)
  • Author(s): Fujioka, A., Terai, K., Itoh, R.E., Aoki, K., Nakamura, T., Kuroda, S., Nishida, E., Matsuda, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. (In press)
• [Journal Article] Local PIP3 accumulation recruits Vav2 and Vav3 to activate Rac1/Cdc42 and initiate neurite outgrowth in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. (2005)
  • Author(s): Aoki, K., Nakamura, T., Fujikawa, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Mol.Biol.Cell 16 Pages: 2207-2217
• [Journal Article] FRET imaging in nerve growth cones reveals a high level of RhoA activity within the peripheral domain. (2005)
  • Author(s): Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Mol.Brain Res. 139 Pages: 277-287
• [Journal Article] Monitoring spatio-temporal regulation of Ras and Rho GTPase with GFT-based FRET probes. (2005)
  • Author(s): Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Methods 37 Pages: 146-153
• [Journal Article] Mechanism and role of localized activation of Rho-family GTPases in growth factor-stimulated fibroblasts and neuronal cells. (2005)
  • Author(s): Kurokawa, K., Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Biochem.Soc.Trans. 33 Pages: 631-634
• [Journal Article] Involvement of the c-Src-Crk-C3G-Rap1 signaling in the nectin-induced activation of Cdc42 and formation of adherens junctions. (2005)
  • Author(s): Fukuyama, T., Ogita, H., Kawakatsu, T., Fukuhara, T., Yamada, T., Sato, T., Shimizu, K., Nakamura, T., Matsuda, M., Takai, Y.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 815-825