プラコード分化を制御する遺伝子発現制御ネットワークの発生遺伝学的解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16570185
• Research Institution: Biomolecular Engineering Research Institute (BERI)
• Principal Investigator: 青田 伸一 技術研究組合, 生物分子工学研究所・分子機能研究部, 主席研究員 (50192456)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡崎 賢二 技術研究組合, 生物分子工学研究所・分子機能研究部, 主席研究員 (50211115)
• Keywords: 発現制御 / 転写因子 / 調節ネットワーク / フィードバック制御 / プラコード / Pax6 / 分化

Research Abstract

水晶体プラコードの分化に重要な役割をはたす転写因子の発現調節ネットワークを解析する目的で、トリ胚と電気穿孔法によるDNA導入を用いたエンハンサーアッセイ法を開発した。レポーター遺伝子にGFPを用い種々のプロモーターを比較したところ、Tk(thimidine kinase)遺伝子のプロモーターで最もよい結果が得られた。このアッセイ系でPax6の水晶体特異的エンハンサー(Pax6EE)のエンハンサー活性を調べた所、水晶体プラコード及びその近傍の外胚葉細胞でエンハンサー活性が検出された。この結果は、トランスジェニックマウスをもちいた解析結果とよく一致し、トリ胚を用いたエンハンサーアッセイの有用性が証明された。トランスジェニックマウスより、はるかに安価、高速であるので、この方法を用いて以後の実験をおこなった。
水晶体プラコードで発現制御ネットワークを形成すると考えられる転写因子遺伝子群の近傍に存在するエンハンサーの探索をおこなった。同定された領域にさらに各種の突然変異を導入し、エンハンサーアッセイをおこない、エンハンサー活性に重要なサイトを同定した。現在、結合する転写因子を解析中である。また、以前Pax6とSox2の結合サイトをPax6EE内に見いだしていたが、この部分には特に集中的に突然変異を導入したところ、これら二つの転写因子が結合していることを支持する結果がえられた。この実験により、Pax6遺伝子の発現には、正の直接的なフィードバック制御がかかっていることが証明された。