2004 Fiscal Year Annual Research Report

糸状菌CCAAT-box結合因子複合体のアセンブリおよびソーティング機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16580057
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	加藤雅士名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (70242849)
Keywords	糸状菌 / CCAAT / Hap / タカアミラーゼA / 転写因子 / アセンブリ / ソーティング / 麹菌
Research Abstract	1)3量体形成に依存したCCAAT-box結合因子サブユニットの核内移行の解析 i)CCAAT-box結合因子複合体サブユニットのアセンブリの順番を決定した。具体的には、複合体形成に伴う各サブユニットの集合の順番を決定するため、GST-HapB,GST-HapC,GST-HapEおよびS^<35>標識したHapB,HapC,HapEを用い、GSTと特異的に結合するグルタチオンセファロース樹脂によるプルダウンアッセイを行った。その結果、まずHapCとHapEのヘテロダイマーが形成された後にHapBが結合しヘテロトリマーが形成されることが明らかとなった。 ii)GFPを用いて各サブユニットの細胞内局在性を調べた。具体的にはGFPとそれぞれのHapサブユニットとの融合タンパク質(3種)を糸状菌Aspergillus nidulansのHapサブユニット欠損株(3種)内の全ての組み合わせ(合計9通り)で発現させ、融合タンパク質の局在性を調べた。その結果、GFP-HapBは単独で核に移行しうるが、GFP-HapCとGFP-HapEは他の2つのサブユニットが存在しないと核移行しないことが明らかとなった。 2)HapC/HapEヘテロダイマー形成によるHapEの分解抑制機構の解析 HapEのΔhapC株内での安定性を調べるために、強力な誘導型のプロモーターであるアミラーゼプロモータ支配下にhapE遺伝子を置いて、ΔhapC株内で強制的にHapEを発現させ、減少していく過程をウエスタンブロット解析により調べた。その結果、HapEの蓄積は検出限界以下であり、ΔhapC株内ではHapEは非常に不安定であり、急速に分解されてしまうことが示唆された。