タンパク質のコンホメーション変化を指標にするプロテオーム解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16590033
• Research Institution: Josai University
• Principal Investigator: 白幡 晶 城西大学, 薬学部, 教授 (50150107)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉田 義昭 城西大学, 薬学部, 講師 (20255029) ; 池口 文彦 城西大学, 薬学部, 助手 (00364711) ; 高尾 浩一 城西大学, 薬学部, 助手 (70337484)
• Keywords: コンホメーション変化 / 蛍光SH基標識試薬 / グアニジン / 蛍光検出HPLC / MALDI-TOF MS / PSD

Research Abstract

タンパク質中SH基を蛍光標識することにより、蛍光検出HPLC、MALDI-TOF MS及びMALDI-PSD TOF MSを用いて、タンパク質のコンホメーション変化をタンパク質中SH基標識量として評価し、コンホメーション変化たタンパク質の網羅的解析の基礎検討を行うことを目的とした。
まず、蛍光SH基標識を合成し、モデルとしてグアニジンにより変性させたタンパク質を標識した。その結果、グアニジンによるタンパク質のコンホメーション変化を、蛍光強度の変化により評価することが可能であった。続いて、その蛍光標識タンパク質を酵素消化後、蛍光検出逆相HPLCに供した結果、グアニジン濃度の増加に伴うタンパク質のコンホメーション変化を蛍光標識ペプチドピーク強度により評価することが可能であった。そして、HPLCピーク画分をMALDI-TOF MS、及びMALDI-PSD TOF MSにて分析したところ、蛍光標識システインを含めたペプチド及びアミノ酸配列解析をそれぞれ可能とした。
次に、タンパク質のコンホメーション変化の網羅的解析の基礎検討実験として、グアニジン変性及び未変性タンパク質を用いて、SH基蛍光標識化合物としてメチレン鎖長1個分即ち分子量が14異なる2種類のSH基蛍光標識試薬により、それぞれ蛍光標識した。酵素消化後、蛍光検出逆相HPLCに供し、そのピーク画分をMALDI-TOF MSにより解析した。その結果、未変性及び変性タンパク質中の標識されたペプチドにおいて、標識の分子量が14異なるシグナルの検出を可能とし、シグナル強度の相対比較を指標に用いることにより、コンホメーション変化の評価を可能とすることを示唆した。