2004 Fiscal Year Annual Research Report
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16590248
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
中村 三千男 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (30091276)
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| Keywords | GTミスマッチ / 特異配列 / アフィニティーカラム |
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| Research Abstract |
新奇GTミスマッチDNAk結合タンパク質(nGTBP)は、TRTRNB配列を持つヘテロ2重鎖DNAに特異的に高親和性に結合する新たなタンパク質である。このとき、Rはグアニンまたはヒポキサンチンであり、チミンとミスマッチを形成している。
nGTBPを精製する目的で、その出発材料を検討した。ヒト胎盤と培養細胞から、後者を選んだ。一挙に大量の材料をヒト胎盤から得るメリットは大きいが、倫理的な問題と無傷性が一定しないためである。
精製段階で測定を経て、最終的に液クロ/質量分析(LC/MS)でnGTBPの部分配列を得るには、精製標品として数ピコモルが必要となった。nGTBPが核抽出液タンパク質中の0.1%を占め、分子量5万、4精製ステップの回収率50%とすると、ヒト骨髄性白血病細胞HL-60亜系C-15の培養量は、約35リットル必要であった。まずその半量を得て、その一部を用いて精製の基礎データを得た。その結果、
1.核抽出液超遠心→ゲル濾過(Superose)→ヘパリンカラム(2M KCl抽出)→G/Cマッチアフィニティーカラム(フロースルー)→G/Tミスマッチアフィニティーカラム(3M KCl抽出)が最も良い事がわかった。
2.測定は、^<32>P-dCTPを用いたFill-Inラベル法で1分子ヘテロ2重鎖プローブあたり5個の^<32>Pを導入し、泳動にはミニゲルを用いる事により、一日に50点以上の高感度測定を可能にした。
3.アフィニティーリガンドは、いくつかの配列の中から、14マーの4タンデム配列を選択し、相補ポリマーを作らないように設計した69マーが有効なことが判明した。
予想以上に大量培養が必要になったこともあり、進行が研究計画よりも大幅に遅れているが、以上の結果をもとに、目下ひとまず数ピコモルの精製標品を得るため、大量培養の残り半分を今年度中に完了する事を目指している。来年度早々、精製標品が得られるものと期待している。
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