アセチルコリンエステラーゼ注入による脳内変化の研究

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591150
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 田子 久夫 福島県立医科大学, 医学部, 助教授 (40171681)
• Keywords: アセチルコリンエステラーゼ / アルツハイマー病 / 塩酸ドネペジル / 大脳皮質 / 海馬 / ウィスター系ラット / アミロイドβ蛋白 / 老人斑

Research Abstract

本年は指摘条件を検討するためにウイスター系ラットの大脳皮質にelectric eelかち抽出されたacetylcholinesterase(AChE:EC3.1.1.7)を注入し、一定の生存期間をおき、脳を固定して凍結切片を作成した後AChE組織化学技法で染色した。
実際には、凍結乾燥されたAChEを生理食塩水を用いタンパク量計算で1%に溶解し、深麻酔下でマイクロシリンジを用い、ラット脳内(大脳皮質右側頭葉、右海馬)に1.0μlを30分間で注入した。注入後は、1日、7日、14日、28日の生存期間をおいた。期間終了後の脳の取り出しは、ラットを深麻酔下で開胸の上潅流固定し摘出後も浸漬固定した。4%パラホルムアルデヒド(PFA)と0.5%グルタールアルデヒド(GLU)を潅流固定液として用い、4%PFAで浸漬後固定液として用いた。固定した脳は、炭酸ガス凍結でクリオスタット切片にし、浮遊切片として用いた。染色の浸透性と均一性を向上させるため浮遊切片のまま、条件を一定に保つため組織化学反応はシェイカー上で行った。反応液は我々がかつて報告した方法(Tago method)を応用し、特異的抑制剤にはBW284C51を用いた。対照染色法として、Cresyl VioletによるNissl染色を行った。
その結果注入後1日目にはまだ変化はなく、注入部位と刺入部位にAchE陽性所見が認められたのみであった。7日目には一部組織の欠損像が認められたものの、AChE陽性所見はなく組織学的な酵素活性は消失していた。14日、28日後も同様であった。なお、サイオフラビンSで染色し蛍光顕微鏡下で観察したが、アミロイド蛋白などの所見は認められなかった。
この1年間では有意な変化は認められなかったが、おそらく溶解濃度と注入量が充分ではなかったものと思われる。AChEを10%溶解で注入すると死亡するラットもいるため、2年目では注入量を調整し検討する予定である。