2004 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
16658033
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
小林 達彦 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 教授 (70221976)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 義輝 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助手 (00323254)
東端 啓貴 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助手 (20344864)
|
|---|
| Keywords | アーキア / ポリA付加酵素 / 大量発現 / RNA末端形成システム / 精製 |
|---|
| Research Abstract |
ポリA付加酵素(poly(A) polymerase : PAP)は、真核生物に特異的と考えられていたが細菌からの発見が報告された。本研究では、未だPAPの報告例のないアーキアの中でも原始生命体に最も近いと考えられている超好熱性アーキアで全ゲノム配列が決定しているPyrococcus horikoshii OT3株から、これらの酵素を解析し、全ゲノム配列が決定している他生物と比較することによって、RNA末端形成システムおよびその役割への理解・タンパク質の分子進化を解析することを目的とした。
PAPの属するnucleotidyltransferase superfamilyで保存されるごく狭い領域のアミノ酸配列の情報を基にPyrococcusのデータベースに対し検索を行い、PAPの極めて有力な候補として(機能未知と登録されている)2つの遺伝子(ORF1、ORF2)を発見した。ORF2をコードする遺伝子用のプライマーを設計し、T7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを宿主として大量発現を試みた。前培養(アンピシリン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml)後、新たに2YT培地に植菌(1%)した。37℃で5時間培養した後、IPTGを終濃度0.1mMになるように加え、28℃でさらに1時間培養した。集菌した菌体を超音波破砕し、遠心後の上澄み液を75℃で15分間熱処理した。硫安分画を行い、その30〜40%画分をサンプルとしてResource Sに供することで、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで(可溶性タンパク質として)精製することに成功した。
|
