2018 Fiscal Year Annual Research Report
Sequence specific detection and manipulation of epigenetic status
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16H03281
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今西 未来 京都大学, 化学研究所, 講師 (80362391)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | メチル化シトシン / TALE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、これまでに検証を進めてきたTranscription Activator-like Effector (TALE)ユニットのメチル化シトシンと非メチル化シトシンとの識別能を利用して、ゲノム中の標的領域のメチル化状態を生細胞内で簡便に検出する方法の構築を行った。単体では活性を持たないが、近接した時にのみ酵素が再構築されて高い活性を示すルシフェラーゼ分割体とメチル化高感受性のTALEとを連結した融合タンパク質を作製した。まず、大腸菌で発現させて精製した２種類の融合タンパク質を用いて、分割体に連結したそれぞれのTALEがDNA上の近接した領域に結合した時に、基質存在下、強い発光が生じることを確認し、メチル化の有無を検出できることを確認した。また、ゲノム中の高度にメチル化されている領域を標的として、HCT116細胞とメチル化酵素欠損株から抽出したゲノムDNAで発光量を比較した結果、メチル化高感受性のTALEを用いた場合には、ゲノムの標的領域のメチル化状態を区別できることが確認された。さらに、ルシフェラーゼ分割体ーTALEをこれらの細胞内で発現させ、培地中に基質を加えて発光量を測定した結果、生細胞においても、この検出系はゲノム中のメチル化状態を区別することが可能であることが示された。RNAのメチル化状態の制御に関しても、RNA結合タンパク質とメチル化酵素の融合体が標的配列選択的な活性を有することを、これまでに構築したRNAメチル化検出系を用いて確認することが出来た。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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