2017 Fiscal Year Annual Research Report
Exploring the implications of cancer-specific mRNA re-splicing events in the robustness and catastrophe of gene expression system
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16H04705
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
前田 明 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 教授 (50212204)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 多久磨 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (10218969)
恵美 宣彦 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (30185144)
白木 良一 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (70226330)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現調節 / スプライシング / mRNA品質管理機構 / 癌 / TSG101 / p53 / RBM4a |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) mRNA再スプライシング抑制因子としてRBM4aを同定した
私たちは156種類のRNA結合蛋白質のsiRNAライブラリーを用いた網羅的ノックダウン実験を行い、１つの因子RBM4aのノックダウンがTSG101 mRNA再スプライシングを顕著に活性化することがわかった。RBM4aは、癌抑制因子として知られており、実際に正常組織では高発現し、進行癌では殆ど発現していない。よってRBM4a蛋白質は正常細胞において異常なmRNA再スプライシングを抑制している極めて有力な候補因子である。再スプライシング活性が強い咽頭癌細胞（TW01）で、RBM4aを過剰発現させると、mRNA再スプライシングが抑制された。しかし正常な乳腺上皮細胞（HMEC）におけるRBM4aの発現をsiRNAでノックダウンしても、mRNA再スプライシングが誘導されなかった。この結果は、正常細胞でmRNA再スプライシングを抑制している因子はRBM4a以外にも存在する事を示唆する。
(2) mRNA再スプライシングを抑制しているRBM4a以外の因子が存在する
p53野生型の細胞株とp53変異型の細胞株でのRBM4aの発現を調べると、はっきりした相関がないので、RBM4a蛋白質の発現は、p53の直下で制御されていないだろう。p53の制御下にあるmRNA再スプライシング抑制因子を探索した。MDM2阻害剤でp53を安定化させるとmRNA再スプライシングが顕著に抑制され、その条件でマイクロアレーを行い、発現変動の見られたRNA結合タンパク質やスプライシング関連因子を選び出した。それらの因子に対するsiRNAを用い、mRNA再スプライシングを指標としてスクリーニングを行った。興味深い事に、スプライシング完了後の成熟mRNAに特異的に結合する複合体EJC（exon junction complex）の中核因子が同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
癌特異的mRNA再スプライシング現象の意義を理解する上で、制御因子（促進因子・抑制因子）を明らかにする事は必須である。１５６種類のRNA結合蛋白質のsiRNAライブラリーを用いた網羅的ノックダウン実験で、幸い、一つの因子RBM4aが同定され、本研究課題のブレークスルーとなった。実際に、その因子の発現がmRNA再スプライシングを抑制することが確認された。
興味深い事に、RBM4aは、癌抑制因子としての報告があり、細胞増殖、アポトーシス、細胞移動能などを制御している。mRNA再スプライシングのグローバルな抑制が、癌抑制に関与しているという魅力的な仮説を提起できる。今後の研究の進展が大いに期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
私たちの発見した癌特異的なmRNA再スプライシング現象が、よく知られた癌抑制因子であるp53とRBM4aに深く関わる事実は、興味深く重要である。なぜなら、私たちは正常細胞で異常なmRNA再スプライシングを抑制しているという状況証拠を得ており、その解明が発癌の抑制につながると考えられるからである。
興味深いことにRBM4a因子は、グローバルに癌関連mRNA前駆体の選択的スプライシングを種々の様式で変化させることが知られている。エクソン除外や遠位５'及び３'スプライス部位選択を促進する場合は、塩基配列特異的にmRNA前駆体の特定の部位に結合することが必要であることが示されているが、mRNA再スプライシング抑制のメカニズムは当然のことながら未知である。mRNA再スプライシングのモデルであるTSG101 mRNAへのRBM4aの結合が、癌細胞でのmRNA再スプライシングの抑制に必要かどうかを、抗-RBM4a抗体を用いた免疫沈降後のRT-PCR、そして結合部位に変異を導入したmRNAのスプライシング解析などで明らかにしたい。また他のスプライシング因子との相互作用は、免疫沈降解析で調べることができる。
マイクロアレーを用いた探索とsiRNAを用いたmRNA再スプライシング活性を指標にしたスクリーニングで、RBM4a以外のmRNA再スプライシング抑制因子候補として、EJCの中核因子が同定できた。EJCはスプライシング依存的に成熟mRNAに結合するので、EJCが再スプライシングを阻害するのは矛盾がない。EJCがスプライシング完了のシグナルになっていると仮定すれば、EJCが結合しなければ、mRNAはスプライシングが未完了と認識され、再スプライシングされるという合理的なシナリオである。EJC中核因子がどのようにmRNA再スプライシングの抑制に関わっているかをぜひ解明したい。
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| Remarks |
研究室のホームページである。
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