2017 Fiscal Year Annual Research Report
Centromere modulation coordinating with higher order cellular functions and development of a next generation human artificial chromosome
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16H04747
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
舛本 寛 公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究部, 室長 (70229384)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セントロメア / ヘテロクロマチン / 人工染色体 / CENP-A / ヒストン交換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体基本機能の制御に乱れが生じるとゲノム機能を破綻させ、細胞死や老化、異常増殖を引き起こす。ヒト人工染色体（HAC）は、裸のDNAを細胞へ導入すると細胞自身が機能する各クロマチン構造を作り上げ、染色体としての機能を維持するシステムである。 本研究では、このヒト人工染色体とtetO配列／各種tetR融合タンパクを用いた構成学的手法を組み合わせ、染色体分配に関わるセントロメア機能構造体形成の全容解明とヘテロクロマチンとの集合バランスの調節メカニズムを明らかにする。これらセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスによりゲノム機能がどのように影響を受け、細胞高次調節機能の異常に繋がるのか、その連係メカニズム解明に迫ると共に、これらの知見を利用してバランスを個別に調節できる次世代人工染色体の開発をめざす。H29年度は（１）セントロメア機能形成の調節因子の解明、（２）クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構解明、（３）クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発、の３つの計画に従って研究を進め,以下の成果を得た。（１）正にも負にもセントロメア機能を調節可能なCENP-Bがクロマチン上に拮抗するヒストン修飾酵素ASH1LとSuv39h1を含む多数因子を集合させることを明らかにした。（２）KAT7がセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスやゲノム機能の維持に強い影響を与えることを明らかにした。（３）次世代型人工染色体構築の基盤となる、tetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの各種合成反復DNAを組み合わせた120kbの長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入して、人工染色体形成効率を向上させる結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）セントロメア機能形成の調節因子の解明：セントロメア機能集合の核となるCENP-Aクロマチンの集合調節因子の選別を進め、人工染色体上にかずさcDNAライブラリーからの各種融合タンパクを結合させ、CENP-Aシグナルの増加／減少（正／負）させる因子を多数得た。CENP-Bは正にも負にもセントロメア機能を調節可能な因子と同定され、さらにCENP-Bがクロマチン上に集合させる因子を調べた結果、ヘテロクロマチン側の調節因子Sub39h1、HP1と共に多数のオープンクロマチン側のヒストン修飾酵素ASH1L, NSD1等を含む多数因子を集合させることを明らかにした。
２）クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構の解明： CENP-Aクロマチンの補充に必須なMis18複合体と相互作用する因子の検索から得たヒストンアセチル化酵素（KAT7）を遺伝子破壊して解析した結果、KAT7がセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスやゲノム機能の維持に強い影響を与えることを明らかにした。
（３）クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発：クロマチン集合バランスをオープン側にするとセントロメア機能形成が促進されるが、ヘテロクロマチン因子の結合はこれを阻害する。一方でヘテロクロマチンは染色分体のコヒージョン維持にも必要であり、人工染色体や染色体分配機能には必要である。そこで、次世代型人工染色体構築の基盤となるtetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの合成反復DNAを作製し、これらを組み合わせた120kbの各種長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入し、それまで5% 前後であった合成DNAによる人工染色体形成効率を30%以上と大幅に向上される結果を得た。
以上の成果に示した通り、計画は予定通り進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの、計画（１）（２）の解析から、CENP-A・CENP-C の下流で集合するMis18複合体は、CENP-Aシャペロン（HJURP）とヒストンアセチル化酵素（KAT7）を同時に集合させる結果を得た。アセチル化の関わるヒストン交換反応とCENP-Aの補充が連係して起こることでセントロメアのエピジェネティックなマークが維持されるメカニズムを明らかにした（Ohzeki et al Dev Cell 2016）。KAT7 KO細胞では、ヘテロクロマチンの集合活性が強まるとヘテロクロマチン構造がセントロメアへ侵入しCENP-Aクロマチンやキネトコア形成を破壊し始めることも明らかになり、KAT7がセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスやゲノム機能の維持に強い影響を与えることが判明した。今後の研究では、（３）クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発： に焦点を絞って研究を進める。アルフォイドDNA中のCENP-B boxに結合するCENP-Bは、クロマチン構造をCENP-Aが集合しやすいオープンなクロマチンやこれと拮抗するヘテロクロマチンのどちらをも形成促進する能力があり、両者のバランス形成に深く関る因子の一つである。そこでtetO配列やLacOを挿入した各種合成アルフォイドDNA（CENP-B box WTとCENP-B box 変異型）を組み合わせて、人工染色体形成活性の向上を目指した次世代型人工染色体の開発を進める。
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