2017 Fiscal Year Annual Research Report
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16H04784
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡本 浩二 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (40455217)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / オートファジー / ユビキチン化 / 小胞体関連分解 / 出芽酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちの研究グループは出芽酵母をモデルに用いて、オートファジーによる選択的ミトコンドリア分解（マイトファジー）の分子基盤をゲノムワイドに獲得し、ミトコンドリアを分解すべき基質として特異的に認識するための分別マーク・タンパク質Atg32を世界に先駆けて同定・解析した。Atg32はミトコンドリア外膜へ局在する膜貫通型タンパク質であり、マイトファジーに特異的かつ必須な、唯一の因子である。これまでの研究で、マイトファジーの初期段階で、Atg32に特異的な高分子量のバンドが出現することを見出している。免疫沈降を行った結果、Atg32の高分子量のバンドにユビキチン陽性シグナルが検出された。そこで、Atg32のユビキチン化に関わるユビキチンリガーゼを探索した結果、小胞体関連分解（ERAD）システムのユビキチンリガーゼDoa10を欠損すると、Atg32のタンパク質レベルが増加することを見出した。。加えて、Doa10欠損細胞ではマイトファジーの誘導が亢進していることもわかった。以上の結果から、ミトコンドリア外膜タンパク質Atg32は小胞体膜のDoa10によって特異的にユビキチン化されていることが示唆された。これらの知見を踏まえた上で本年度は、Doa10とAtg32との関連性を調べた。
まず、Doa10がAtg32を基質タンパク質として結合するかどうかを明らかにするため、免疫共沈降を用いて解析した結果、両者の相互作用が検出された。次に、Atg32の細胞内局在を調べるため、Atg32に3コピーのGFPを付加し（Atg32-3GFP）、その細胞内局在を蛍光顕微鏡を用いて解析したところ、Doa10欠損細胞ではミトコンドリア局在に加えて、小胞体局在も検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究で、Atg32はその一部が小胞体へと運ばれ、Doa10によるユビキチン化を受けて分解される可能性を提起している。通常、ユビキチンE3リガーゼとその基質タンパク質の相互作用は一時的なものであり、結合を検出するのは容易ではない。そこで、一時的な相互作用を捉えるため、化学架橋剤で処理した細胞からAtg32を精製し、Doa10を検出することができた。また、E3リガーゼ活性を失ったDoa10変異体を用いることで、化学架橋なしにAtg32とDoa10の相互作用を免疫共沈降で捉えることが可能となった。これらの結果から、Atg32はDoa10の基質タンパク質となりうることが示唆される。
また、Atg32の細胞内局在を解析するため、染色体上のATG32遺伝子に3コピーのGFPをタギングし、内在性プロモーターで発現したAtg32-3GFP局在アッセイ系を確立した。Atg32-3GFPは内在性のAtg32と同様のマイトファジー活性を持っており、1コピーのGFPタギングでは不可能だったAtg32の局在パターンの可視化が可能となった。このアッセイ系を用いてDoa10欠損細胞を観察したところ、従来のミトコンドリアパターンに加えて、小胞体パターンも見えることが判明した。これらのデータから、野生型細胞において、小胞体に運ばれたAtg32をDoa10が認識・結合し、ユビキチン化することで、Atg32をプロテアソーム分解系へと導いていること、Doa10欠損によってAtg32の分解が阻害され、小胞体へ蓄積することが考えられる。
このように、実験系を工夫することにより、タンパク質間相互作用や細胞内局在の解析が可能となっただけでなく、ミトコンドリア外膜タンパク質が小胞体へも局在しうるという予想外かつ興味深い発見に至ったことから、本研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究計画として、（１）小胞体膜へのタンパク質の輸送に関わる因子の関与を検討するため、Doa10および候補因子の二重遺伝子破壊株を作成し、Atg32-3GFPの小胞体局在が影響を受けるかどうかを調べる。（２）小胞体とミトコンドリアとの接触部位（ERMES）を経由してAtg32がミトコンドリアから小胞体へ移動している可能性を検証するため、Doa10およびERMES構成タンパク質の二重欠損細胞でAtg32-3GFPの小胞体局在が影響を受けるかどうかを調べる。（３）これまでの研究で、ペルオキシソームに人為的に限局させたAtg32は、Doa10による制御を受けないことがわかっている。そこで、このペルオキシソームアンカー型Atg32がDoa10欠損細胞で小胞体パターンを示すかどうか、蛍光顕微鏡観察を行う。（４）Doa10欠損細胞で小胞体に局在したAtg32が小胞体特異的オートファジー（ERファジー）を駆動しうるかどうか明らかにするため、ERファジーマーカーを発現した酵母株を用いてDoa10およびERファジーの必須因子であるAtg39/Atg40の三重欠損細胞を作成し、蛍光顕微鏡とウェスタン解析でERファジーを調べる。必要に応じ、Atg32の過剰発現も試みる。
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| Remarks |
研究室ホームページ
http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/okamoto/Okamoto_Lab/
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Research Products
(6 results)
