2016 Fiscal Year Annual Research Report
深海底熱水活動域が育む微生物共生系：第三の分子生物学で紐解く生物間相互作用
| Project/Area Number |
16H04843
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
中川 聡 京都大学, 農学研究科, 准教授 (70435832)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 糖鎖 / 共生 / 深海底熱水活動域 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、深海底熱水活動域において共生関係にある化学合成微生物―大型生物間の相互作用を、世界で初めて第三の分子生物学（=グライコミクス）の観点から解明することにある。具体的には、微生物の『糖鎖と修飾タンパク質の組み合わせが、特定生物間の共生を成立させる分子基盤である』という独自の仮説を検証するため、申請者が深海微生物に見いだしてきた(1)特異糖鎖の生合成経路（糖鎖関連遺伝子の発現様式・破壊実験・酵素化学的性状）、(2)糖鎖修飾タンパク質の機能・修飾様式（糖タンパク質のプロテオーム）を、細胞外共生系および細胞内共生系のそれぞれにおいて解析する。本研究は深海底における異種生物間の分子的コミュニケーション手段の研究を通じて、人類に蔓延する病原性微生物の誕生過程の解明、さらには共生（感染）メカニズムを標的とした革新的治療法の開発に益することを目指している。
平成28年度は、深海底熱水活動域に固有の化学合成微生物群が有する糖鎖関連遺伝子群の機能解析を進めた。平成27年度に実施した調査航海において、中部沖縄トラフに位置する深海底熱水活動域（水深は約1000m、噴出熱水の最高温度は311度）から採取し飼育中の甲殻類（ゴエモンコシオリエビと呼ばれる。腹部剛毛に莫大な付着共生微生物を有する）を主要な解析対象とし、主に(a)メタゲノム解析による糖鎖関連遺伝子群の同定、(b)糖鎖関連酵素の発現・精製、(c)糖鎖関連酵素の性状解析を実施した。(b)において、大腸菌の形質転換および発現誘導・精製が想定より困難であったが、無細胞系を用いることにより当面の性状解析に足る量の糖鎖関連酵素群を取得することに成功している。なお、以上に関連する成果の一部は複数の学会や国際誌等で報告した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生態学的に重要かつ産業的利用価値も高いと考えられる糖鎖関連酵素群を取得することに成功し、性状を解析している。大腸菌の形質転換および発現誘導・精製が想定より困難であったが、無細胞系を用いることにより当面の問題は解消したと考えられ、これらは今後種々の解析において基盤的役割を果たすと考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は、次の解析を実施し、主に糖鎖修飾タンパク質の機能の解明を目指す。まず、糖タンパク質の機能を同定するため、外部共生微生物および分離株からタンパク質を調整し、2次元電気泳動で分離する。シッフ反応により全糖鎖を染色し、ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）法に供する（機能・局在性の同定に必要なゲノム情報は昨年度までの研究で取得することに成功している）。近縁病原菌であるCampylobacterでは同手法により65種類の糖タンパク質が既に同定されているため、本解析で得られる結果と比較することが可能である。また、これまでの研究において、宿主生物の体液に共生微生物細胞表層を特異的に認識する物質が存在することを見出していることから、共生微生物のタンパク質をアフィニティー精製し1-aと同様に解析することで、生物間相互作用に特に強く関わる糖タンパク質を同定する。次に、タンパク質の糖鎖修飾部位を決定する。具体的には、上記で調整した糖タンパク質をIGOT法に供し、糖鎖修飾部位（特定のアミノ酸配列）を決定する。さらにタンパク質から切り出した糖鎖を精製・ラベル化し、MALDI-TOFMS等を用いて構造解析する。なお計画通り糖鎖が切り出せない場合、ヒドラジン分解法もしくはプロナーゼ分解法を用いる。
|
