2018 Fiscal Year Annual Research Report
Integration of structural basis for secondary metabolite biosynthesis, regulation, and morphological development coded on the Streptomyces genome
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16H04917
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
荒川 賢治 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (80346527)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 二次代謝産物 / アゾキシアルケン / 生合成 / ピロロキノリンキノン / 形態分化 / 制御カスケード / シグナル分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放線菌Streptomyces rochei 7434AN4株は、３つの線状プラスミドpSLA2-L, -M, -Sをもち、２つのポリケチド抗生物質ランカサイジン(LC)・ランカマイシン(LM)を生産する。本研究では、放線菌における二次代謝生合成、形態分化、シグナル分子制御の統合深化を目指し、平成30年度は以下の３課題を遂行した。
(1) 特異生合成マシナリーの機能解析【二次代謝生合成】
まず、アゾキシアルケン化合物KA57-Aの生合成マシナリーに注目した。KA57-A生合成遺伝子(azx)クラスター中のポリケチド生合成酵素(PKS)遺伝子について、遺伝子破壊株の代謝プロファイル変化を解析したところ、親株と変化が見られなかった。クラスター中のPKSはKA57-A生合成に関与していないことが強く示唆された。また、LC生合成におけるキノン要求性デヒドロゲナーゼOrf23の機能解析を行い、基質特異性を明らかにした。
(2) 多面発現制御による未同定二次代謝産物の抽出と生合成【シグナル分子制御】：シグナル分子結合部位Trpが保存されていた転写リプレッサーについて遺伝子変異を施したところ、親株に見られない化合物の蓄積が認められ、フェニルプロパノイドや芳香族アミノ酸誘導体であった。これらの蓄積原因に関して興味が持たれる。
(3) ゲノム比較による形態分化関連遺伝子の抽出と同定【形態分化】
染色体末端欠失株において、「2-39株以外に共通して見いだされる領域」に気中菌糸形成因子の存在が示唆されたため、該当する138 ORFs (SRO_6607-SRO_6744) (nt 7,275-7,431 kb of the 7434AN4 chromosome) に注目した。そのうちの１つwhiBの相補株についてコロニー生育及びSEM測定を行ったところ、コントロール株との顕著な差異は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【二次代謝生合成】：[課題１]アゾキシアルケン化合物の生合成マシナリーの先導的解明、[課題４]ポリケチド合成酵素の機能同定とハイブリッド抗生物質の創製、[課題６]比較メタボロームによる未同定二次代謝産物の抽出と生合成
[課題１]において、アゾキシアルケン化合物マニワマイシン生合成遺伝子クラスターの次世代シークエンス解析も行い、バラニマイシン、KA57-Aとの共通ORFを抽出できた。また[課題４]において、ポリエン化合物ペンタマイシンの生合成クラスターについて、P450酵素の遺伝子破壊実験により確認した。さらにC10の直鎖ポリケチド化合物シトレオジオールの生合成遺伝子について、C-メチル基転移酵素を指標に探索し、該当クラスターを３つにまで絞り込んだ。また、LC生合成におけるキノン要求性デヒドロゲナーゼの機能解析を達成した。
【形態分化】：[課題２]染色体環状化株における欠失領域の特定、[課題５]ゲノム比較による形態分化関連遺伝子の抽出と同定
[課題２]において、次世代シークエンスにより欠失領域の推定に成功した。しかし、ロングリードに長けているPacBioシークエンスにおいても、両端融合配列の取得には至らなかった。当該領域にトランスポゾンなどきわめて高度な重複配列の存在が考えられた。[課題５]において、未解明形態分化関連遺伝子の存在が示唆された138ORFの解析に着手している。
【シグナル分子制御】：[課題３]シグナル分子制御シグナルカスケードの網羅的解析、[課題７]多面発現制御による休眠二次代謝のゲノムマイニング
[課題３]において、リプレッサーsrrB変異について、遺伝子発現と代謝の経時変化を指標に解析したところ、活性化因子srrYの後期発現がSrrBによって抑制されることが分かった。[課題７]においてリセプター遺伝子の変異解析により、通常非生産の代謝産物活性化を見いだした。
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| Strategy for Future Research Activity |
【二次代謝生合成】：[課題１]にて掲げるアゾキシアルケン化合物の特異なアゾキシ結合形成メカニズムについて、今後は共通因子に絞り込んで網羅的遺伝子破壊実験を行う。さらに、in silico比較解析と酵素変換実験なども組み合わせ、アゾキシ結合形成メカニズムの先駆的解明を目指す。さらに[課題６]に着手し、本菌の休眠二次代謝産物と考えられている特異生合成マシナリー（C-P化合物、擬オリゴ糖など）の遺伝子発現活性化と代謝産物取得を目指す。
【形態分化】：各染色体環状化株における表現型と遺伝子欠失領域の関係を明らかにし、次いで、欠失領域の遺伝子相補実験を行う。具体的には、まず、コスミドの取得やPCR walkingによる融合配列の取得を目指す。それと並行して、欠失領域に含まれる138ORFのうち、6つの制御遺伝子に着目し、これらをクローニングして2-39株に形質転換し、胞子形成の回復の有無を調べる。
【シグナル分子制御】：現在までに制御遺伝子改変による代謝増強・休眠二次代謝の覚醒戦略を立案できた。今後は生合成クラスターの発現標的の特定なども行い、制御カスケードの全貌解明を目指す。
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