2016 Fiscal Year Annual Research Report
褐藻類にみられる有用物質の代謝関連酵素の同定と高度変換技術の開発
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16H04977
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井上 晶 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (70396307)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾島 孝男 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (30160865)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 褐藻類 / 多糖類 / カロテノイド / アルギン酸 / マンヌロン酸C5-エピメラーゼ / アルギン酸リアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、褐藻類にみられるユニークかつ有用な糖質とカロテノイドの生合成や代謝機構を明らかにするために、これらに関わる酵素の探索を進め、生化学的手法を用いて機能解析を進めるものである。本年度は、褐藻類に多量に含有されている酸性多糖類アルギン酸の合成および代謝とカロテノイドの合成関連酵素に着目し、以下の成果を得た。
アルギン酸に関しては、その合成の最終段階で作用するマンヌロン酸C5-エピメラーゼの遺伝子を得て、昆虫細胞発現系により組換えタンパク質の生産に成功した。得られた組換えタンパク質は、ポリマンヌロン酸を基質としてエピメラーゼ活性を示した。この酵素のエピマー化パターンは、マンヌロン酸が連続する領域に対して、1つ置きにグルロン酸へとエピマー化し、最終産物として約50%のグルロン酸含量からなるアルギン酸を生じることが分かった。さらに、マコンブ胞子体のトランスクリプトーム解析の結果、同酵素には少なくとも13個のアイソフォームが発現している可能性が明らかになった。
現在までに褐藻類中にアルギン酸を分解する酵素の存在は示唆されていないが、トランスクリプトームデータより3つのアルギン酸分解酵素様タンパク質の存在が示唆された。これらの候補タンパク質については、各cDNAのクローニングを行い、それらのうち1つについては組換えタンパク質を発現し、実際にアルギン酸分解能をもつことを確認した。
カロテノイド合成関連酵素については、一般的にこれらは膜タンパク質であるため、試験管内での反応は困難と考えられた。そのため、マコンブのカロテノイド合成酵素探索のためのプラットフォームとして用いるために、フラボバクテリウム属UMI-01株から4つの酵素遺伝子をクローニングし、これらを大腸菌に導入することでβ-カロテン合成能をもつ組換え大腸菌を作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
真核生物では初めて活性をもつマンヌロン酸C5-エピメラーゼの発現方法を確立することに成功し、機能を解析することに成功した。本発現方法は、同酵素の他のアイソフォームの発現生産にも有効と考えられ、褐藻類が多様な配列をもつアルギン酸を合成する機構を酵素分子レベルで明らかにするための基盤技術となると考えている。
シオミドロなど他の褐藻類のゲノム情報が蓄積しつつあるが、未だに褐藻類ではアルギン酸分解酵素の存在は確認されていない。しかしながら本研究では、3つのアルギン酸分解酵素候補遺伝子に着目し、少なくともそれらのうち1つのものについては分解活性をもつことが分かった。今後、詳細に本酵素の機能解析を進めることで、褐藻類のアルギン酸分解機構を明らかにすることが可能となった。
カロテノイド合成関連酵素については、カロテノイドが水に不溶性であることや酵素が膜タンパク質と考えられることから、その活性評価が困難と予測されたが、β-カロテン合成能をもつ大腸菌を作成することでこの問題を克服することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
アルギン酸分子中のマンヌロン酸とグルロン酸の構成比とそれらの配列を決定するマンヌロン酸C5-エピメラーゼについては、トランスクリプトーム解析により見出されたアイソフォームの各遺伝子のクローニングを進めて、昆虫細胞発現系により組換えタンパク質を生産する。可溶性タンパク質として得られたものについては、機能解析を進めて各アイソフォームの特徴、特にエピマー化パターンを明らかにする。
アルギン酸分解酵素については、候補として挙げた3つのうち、1つのものについては分解活性をもつ組換え酵素を得ることができた。これについては、詳細な性状解析を進めていく。また、他の2つのものについては可溶性タンパク質として発現することが困難であったため、今後、発現ホストや培養条件の検討を行う。
カロテノイド合成関連酵素については、β-カロテンを合成する組換え大腸菌の構築に成功したので、これをプラットフォームとして研究を進める。すなわち、マコンブのトランスクリプトームデータベースから候補タンパク質を探索し、それらをコードする遺伝子のクローニングと上記大腸菌への導入を行い、合成され細胞内に蓄積したカロテノイドの構造解析を進める予定である。
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Research Products
(2 results)
