受精卵への顕微注入に拠らない簡便な動物個体ゲノム操作法の開発

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05049
• Research Institution: National Defense Medical College
• Principal Investigator: 中村 伸吾 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 防衛医学研究センター, 講師 (00505323)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石原 雅之 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 防衛医学研究センター, 教授 (10508500) ; 佐藤 正宏 鹿児島大学, 学内共同利用施設等, 教授 (30287099) ; 大塚 正人 東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 遺伝子導入 / ゲノム編集 / 遺伝子改変マウス / 発生工学

Outline of Annual Research Achievements

近年ゲノム編集技術が登場し、それを用いた動物個体における標的遺伝子のノックアウト（KO）実験は盛んに行われている。その主流は、受精卵へゲノム編集成分を直接顕微注入する「zygote injection（受精卵への顕微注入）」であるが、そのためには、高価な装置とそれを操作する人的スキル、受精卵の採取、注入胚の仮親マウス生殖道への移植等の煩雑な処置が必要となる。本研究では、この様な「受精卵への顕微注入」には拠らない、遺伝子改変個体を簡便に作製するための新たな技術を模索している。具体的には、我々が開発をしてきた幾つかの簡便な遺伝子導入手法に対し、CRISPR/Cas9（CRISPR系）ゲノム編集技術の適用可否を検討し、これを遺伝子改変マウス作製のための新たな基盤技術として活用したいと考えている。
平成28年度は、これまでに確立されているGONAD法の改良研究を行った（実験１）。また、上記主旨に則り、遺伝子改変個体の簡便な作製系の構築にこれまでの経験から役立つと思われる、着床前胚への核酸/試薬複合体を用いた遺伝子導入系を利用した実験（実験２）、胎盤経由による妊娠中期胎仔への核酸導入系を利用した実験（実験３）にそれぞれ着手した。
その結果、（１）GONAD法の改良研究においては、遺伝子改変個体の作製効率の向上がみられた。（２）着床前胚への核酸/試薬複合体を用いた遺伝子導入系を利用した実験では、着床前胚の回収とその培養系を立ち上げて透明体除去に関する手技を確認し、本研究に使用する試薬類の選定を行った。また、交雑群マウスを利用して採卵数を増やすこととした。（３）胎盤経由による妊娠中期胎仔への核酸導入系を利用した実験では、EGFPを有する妊娠中期胎仔に対して、数種の遺伝子導入試薬を用いて遺伝子導入を実施してこれが機能することを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請書に記載した平成28年度の研究計画に基づいておおむね順調に研究は進展している。

Strategy for Future Research Activity

当初の予定通り、平成28年度の研究を継続すると共に卵巣および精巣における遺伝子導入系を用いたゲノム編集核酸の導入実験を実施する。

Research Products

• [Journal Article] The piggyBac-Based Gene Delivery System Can Confer Successful Production of Cloned Porcine Blastocysts with Multigene Constructs. (2016)
  • Author(s): Sato M, Maeda K, Koriyama M, Inada E, Saitoh I, Miura H, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S, Miyoshi K.
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 17 Pages: －
  • DOI: 10.3390/ijms17091424.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Low-molecular weight heparin protamine complex augmented the potential of adipose-derived stromal cells to ameliorate limb ischemia. (2016)
  • Author(s): Kishimoto S, Inoue K, Nakamura S, Hattori H, Ishihara M, Sakuma M, Toyoda S, Iwaguro H, Taguchi I, Inoue T, Yoshida K.
  • Journal Title: Atherosclerosis. Volume: 249 Pages: 132-139
  • DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2016.04.003.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cytotoxicity of Silver Nanoparticle and Chitin-Nanofiber Sheet Composites Caused by Oxidative Stress. (2016)
  • Author(s): Kinoda J, Ishihara M, Hattori H, Nakamura S, Fukuda K, Yokoe H.
  • Journal Title: Nanomaterials (Basel). Volume: 6 Pages: -
  • DOI: 10.3390/nano6100189.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enhanced effect of fibroblast growth factor-2-containing dalteparin/protamine nanoparticles on hair growth. (2016)
  • Author(s): Takabayashi Y, Nambu M, Ishihara M, Kuwabara M, Fukuda K, Nakamura S, Hattori H, Kiyosawa T.
  • Journal Title: Clin Cosmet Investig Dermatol. Volume: 9 Pages: 127-134
  • DOI: 10.2147/CCID.S108187.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] マウスすい臓内への piggyBac系を介した直接生体内遺伝子導入は外来遺伝子の長期発現を可能とする (2016)
  • Author(s): 佐藤正宏, 稲田絵美, 齋藤一誠, 三浦浩美, 大塚正人, 中村伸吾, 桜井敬之, 渡部聡.
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] piggyBacベクターシステムとin vivo gene transferを用いた新たな肝細胞株樹立の試み (2016)
  • Author(s): 渡部聡, 中村伸吾, 桜井敬之, 大塚正人, 佐藤正宏.
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] piggyBac遺伝子導入系により複数遺伝子が同時導入されたブタ細胞は核移植後のクローン胚の発生を保証する (2016)
  • Author(s): 佐藤正宏, 前田昂亮, 郡山実優, 稲田絵美, 齋藤一誠, 大塚正人, 中村伸吾, 桜井敬之, 渡部聡, 三好和睦.
  • Organizer: 第109回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 麻布大学
  • Year and Date: 2016-09-11 – 2016-09-15