2017 Fiscal Year Annual Research Report
構造解析を基盤としたタイトジャンクションクローディンファミリーの分子生理学的解析
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16H05121
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
田村 淳 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (00362525)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タイトジャンクション / 上皮細胞 / 細胞間接着装置 / 構造解析 / ストランド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞は、多細胞生物の体内外表面をおおい、皮膚・肝臓・腎臓などの主要な機能と構造を担う生体内最多の細胞群である。上皮細胞は、細胞間接着装置で互いに結合し、上皮細胞シート構造を構築する。上皮細胞は高度に分化しつつシート構造をつくることで、皮膚のように体内と体外のバリアとなったり、腸管上皮のように栄養を吸収しながらも、一度吸収された栄養分が腸管内に戻らない仕組みを形成している。上皮細胞シートの形成は、上皮細胞間に、クローディン(Cldn)ファミリータンパク質により構築されるタイトジャンクション（TJ:密着結合）が存在する。TJは、Cldn分子の重合により形成されるストランド構造により細胞間透過性を制御することで、生体機能のための組織微小環境を構築する。そのことは逆に、TJ機能が破綻すると、適切な生体微小環境が構築されず、その結果として、生体の機能不全とさまざまな病的状態が生じることを示す。
申請者は、複数のCldnノックアウト（KO）マウスを解析することで、TJ機能がバリアばかりでなく栄養吸収や肝胆汁循環など生体の正常な機能に欠かせないことを示してきた。本申請では、これまでに確立したノックアウトマウスの解析をさらに進めることで、Cldnの生体機能の解明を進める。しかし、単一CldnのKO解析では、欠失したCldnそのものの機能を直接みているか、残ったCldnの機能を見ているか、明確に示すことは不可能な場合が多い。そこで同時に、ゲノム編集技術を用いてCldnのない細胞を確立し、１つ１つのCldnサブタイプの機能と構造の理解を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）ゲノムの編集技術を用いて、Cldnの発現の少ないあるいは欠失した細胞の樹立を進め、単一Cldnの解析を進める。本系の進行を進めている。
（２）Cldnのノックアウトマウス解析を進めた。本年度は特に、胃に発現の多いCldnと、肺に発現の多いCldnのノックアウトマウスの解析を進めた。胃のCldnでは、長期のTJ機能障害では、初期の胃上皮細胞のバリア障害により生じた、活動性炎症をともなうSPEMと呼ばれる化生性変化が、週齢を重ねるにつれ、特定のサイトカインの分泌をともないながら慢性炎症化すること、炎症の持続が次のサイトカインにより幹細胞性を獲得した上で、さらに他のサイトカインの誘導により腫瘍を形成する状態を詳細に検討した。肺に発現の多いCldnについては、その表現型解析を進め、肺胞を形成する特定の細胞の増殖亢進を見出している。また、肺胞内での特定物質の濃度上昇の有無の検討など進めている。本マウスは、特に、LPSなどを用いた感染模倣実験に対する感受性が高く、肺のバリア障害が原因の１つと考えられる。しかし、易感染性を示す原因として、複数の理由が示唆されるため、詳細な検討がさらに必要である。
（３）上皮細胞間の水の透過性の定量的実験は、生体における細胞間バリア機能上欠かせず重要な実験である。そのためのシステムの構築を進めている。現状では、トリチウム水を用いた透過性実験の系を樹立、計測を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度には、以下の計画を遂行予定である。
（１）解析に適した細胞系統の樹立：Cldnの発現の少ないまたは欠失した上皮細胞系の樹立と解析を進める。（２）微小な電気信号や水分子出納を捉えられる生理学的装置の確立：Cldn15の結晶構造が解かれたことから、Cldn15がつくるTJ-ポアの構造予測が可能となった。選択性に関わる重要なアミノ酸の位置推定も可能であるが、実験的な検証が必要である。細胞間に異なるCldnを発現するヘテロの細胞間TJの機能を知りたい場合、２細胞の間にTJを構築し、その部分の生理学的な解析をすること等が必要である。また、TJ間の水の透過性は、上皮組織の浸透圧や、さまざまなサイトカインの濃度の変動などとも関連し、重要である。水の透過性を測定する系を樹立する。現在、アイソトープを用いて進めている系を、改良する。（３）生物学的な機能との相関をin vitroの系で再現するorgan on chipシステムの確立：Cldn KO細胞を得て、クローディンサブタイプごとの特性が理解されたら、それぞれのサブタイプが、生体内の種々の恒常性を維持可能か、可及的純粋にTJ特性を取り出して、生体内を模倣したシステムで、検討できるorgan on chip法の導入を進める。（４）CldnKOマウスの解析を進める。
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