2016 Fiscal Year Annual Research Report
臓器をシングルセルに３次元分解する空間分画技術の創出
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16H06077
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
寺尾 京平 香川大学, 工学部, 准教授 (80467448)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | １細胞解析 / ナノ加工 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、臓器を物理的に切断し、1細胞サイズまで微小分割することで、立体的な臓器を空間的に「３次元分解」する新たな解析技術の確立を目指す。シリコンナノ加工技術により実現した独自技術であるシングルセルの一括切断技術をベースに、脳・腎臓等の様々な臓器を細胞レベルまで空間的に分割することで、多様な組成をもった微小臓器断片を得る。
本年度以下の２項目について実験技術の構築と検証を行った。（１）生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作：超高精度電子線描画装置・マスクレス露光装置とICP-RIE装置を利用したシリコンナノプロセスにより、100～20000 nmサイズの幅を持つ刃状構造（ナノブレード）を有した空間分画デバイスを作製した。物理的な切断によって、サブセルあるいはシングルセルレベルの空間分布を一度に得るため、１区画が１辺500nm～200μm角程度の格子となっており、それが20 mm×20 mm以上の領域にアレイ状に並ぶ構造を設計した。その結果、良好にデバイスは作製され、100μm角を超えるサイズの区画に関しては貫通孔が形成された。
（２）臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築：押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるために、ゲルを支持基板にコートした柔軟で、かつ支持基板自体が破壊しない強度を持つ臓器サンプル保持担体を作製し、ナノブレードを押圧できる構造とし、臓器分画を実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究目的である、臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、以下の４つの項目について実験技術の構築と検証を行う計画である。（１）生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作、（２）臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築、（３）モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した、空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証を行う。最終的に、（４）３次元立体的臓器を(3)の切断操作とスライド操作の繰り返しによって、「臓器丸ごと」切断回収する機構を実現する。
本年度以下の２項目について実験技術の構築と検証を行った。
（１）臓器用空間分画デバイスの製作：生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作：超高精度電子線描画装置・マスクレス露光装置とICP-RIE装置を利用したシリコンナノプロセスにより、100～20000 nmサイズの幅を持つ刃状構造（ナノブレード）を有した空間分画デバイスを作製した。物理的な切断によって、サブセルあるいはシングルセルレベルの空間分布を一度に得るため、１区画が１辺500nm～200μm角程度の格子となっており、それが20 mm×20 mm以上の領域にアレイ状に並ぶ構造を設計した。その結果、良好にデバイスは作製され、100μm角を超えるサイズの区画に関しては貫通孔が形成された。
（２）切断機構の開発：押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるために、ゲルを支持基板にコートした柔軟で、かつ支持基板自体が破壊しない強度を持つ臓器サンプル保持担体を作製し、ナノブレードを押圧できる構造とし、臓器分画を実証した。
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| Strategy for Future Research Activity |
期間内に、臓器空間分画技術によって、モデル生物の臓器（マウス脳・腎臓）の物理分割を行い、イメージングにより簡易評価することで、本提案原理の実証まで達成することを目標にしている。一方で、臓器分画は定量網羅的計測のための前処理操作の位置付けであることから、実際の応用に繋げるためには、期間中に分画後の計測に繋がる道筋を得ることが重要と考えている。そこで、分画技術の開発と並行して、マイクロアレイ・ビーズアレイを利用した網羅的解析手法の検討をを検証する。
実験技術については現在の（１）（２）の課題に継続して取り組み、デバイスの精度と実験時の扱いやすさを向上し、実証実験を進める計画である。また、（３）（４）の課題についても今度下記のように取り組み計画である。
（３）モデル臓器による実証とイメージング：使用する臓器サンプルは、サイズや硬さの面で比較的扱いが容易、かつ研究ターゲットとしても重要なマウスの脳と腎臓に設定した。まずは、臓器をマイクロスライサー等の既存の方法で薄片化したサンプルに対して、１細胞のサイズに２次元的に分割する。またそのときの細胞毎の挙動を細胞核の蛍光染色によってイメージングを行うことで、細胞空間配置に影響を与えない分画条件・パラメータを検討する。
（４）臓器分画の３次元化：切断分割する対象を２次元的な小切片から３次元的な臓器に発展させる。１細胞深さ分だけ垂直に臓器を切断した後にデバイスを水平方向に高精度に移動させるスライド機構を構築し、「Step & Repeat」方式によるマウス脳・腎臓の３次元分画を試行する。
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