2017 Fiscal Year Annual Research Report
臓器をシングルセルに３次元分解する空間分画技術の創出
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16H06077
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
寺尾 京平 香川大学, 工学部, 准教授 (80467448)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | マイクロ・ナノデバイス / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、臓器を物理的に切断し、1細胞サイズまで微小分割することで、立体的な臓器を空間的に「３次元分解」する新たな解析技術の確立を目指す。シリコンナノ加工技術により実現した独自技術であるシングルセルの一括切断技術をベースに、脳・腎臓等の様々な臓器を細胞レベルまで空間的に分割することで、多様な組成をもった微小臓器断片を得る。
本年度以下の３項目について実験技術の構築と検証を行った。（１）生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作：マウス臓器スライスをターゲットとして貫通孔を有したナノブレードアレイの作製条件、及び構造解析により強度に関する検討を行った。結果として、シングルセルサイズの貫通孔を有した様々なブレードアレイデバイスを完成させるとともに市販容器との適合性を考慮したチップ形状を実現した。
（２）臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築：押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるため、ナノブレードを保持する機構について開発を行った。また、操作性向上のためアタッチメント式で交換が容易なブレードデバイス脱着機構を考案した。（３）モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証：マウス脳スライスをサンプルとして、空間分画を行い、各区画への薬液吐出時に隣接区画にリークがないことを確認し、それぞれの区画が独立した溶液層として利用できることを示し、細胞ライセートの逐次回収を実現した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究目的である、臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、以下の４つの項目について実験技術の構築と検証を行う計画である。（１）生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作、（２）臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築、（３）モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した、空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証を行う。最終的に、（４）３次元立体的臓器を(3)の切断操作とスライド操作の繰り返しによって、「臓器丸ごと」切断回収する機構を実現する。
本年度以下の３項目について実験技術の構築と検証を行った。（１）生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体（ナノブレード）を有した空間分画デバイスの製作：マウス臓器スライスをターゲットとして貫通孔を有したナノブレードアレイの作製条件、及び構造解析により強度に関する検討を行った。結果として、シングルセルサイズの貫通孔を有した様々なブレードアレイデバイスを完成させるとともに市販容器との適合性を考慮したチップ形状を実現した。（２）臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築：押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるため、ナノブレードを保持する機構について開発を行った。また、操作性向上のためアタッチメント式で交換が容易なブレードデバイス脱着機構を考案した。（３）モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証：マウス脳スライスをサンプルとして、空間分画を行い、各区画への薬液吐出時に隣接区画にリークがないことを確認し、それぞれの区画が独立した溶液層として利用できることを示し、細胞ライセートの逐次回収を実現した。
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| Strategy for Future Research Activity |
期間内に、臓器空間分画技術によって、モデル生物の臓器（マウス脳・腎臓）の物理分割を行い、イメージングにより簡易評価することで、本提案原理の実証まで達成することを目標にしている。一方で、臓器分画は定量網羅的計測のための前処理操作の位置付けであることから、実際の応用に繋げるためには、期間中に分画後の計測に繋がる道筋を得ることが重要と考えている。そこで、分画技術の開発と並行して、マイクロアレイ・ビーズアレイを利用した網羅的解析手法の検討をを検証する。
実験技術については現在の（１）（２）の課題に継続して取り組み、デバイスの精度と実験時の扱いやすさを向上し、実証実験を進める計画である。また、（３）（４）の課題についても今度下記のように取り組み計画である。（３）モデル臓器による実証とイメージング：使用する臓器サンプルは、サイズや硬さの面で比較的扱いが容易、かつ研究ターゲット
としても重要なマウスの脳と腎臓に設定している。今後引き続き、臓器をマイクロスライサー等の既存の方法で薄片化したサンプルに対して、空間分画を行い、各区画からの微量ライセートの回収と転写産物網羅解析に取り組むことで実証実験を進める計画である。
（４）臓器分画の３次元化：切断分割する対象を２次元的な小切片から３次元的な臓器に発展させる。１細胞深さ分だけ垂直に臓器を切断した後にデバイスを水平方向に高精度に移動させるスライド機構を構築し、「Step & Repeat」方式によるマウス脳・腎臓の３次元分画を試行する。
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