2016 Fiscal Year Annual Research Report
テロメアクライシスにおける染色体不安定化機構の解明
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16H06176
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
林 眞理 京都大学, 白眉センター, 特定助教 (90761099)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | テロメアクライシス / テロメア脱保護 / M期停止 / 細胞周期 / BLM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.比較的安定に染色体を保持している上皮細胞由来のヒトがん細胞株HCT116に対し、研究計画に沿って染色体改変を行った。Splicing donorとacceptorによって２つに分離された蛍光タンパク質mCitrineを保持する人工DNAカセットをX染色体短腕のサブテロメア領域に相同組み替えを利用して挿入した。目的とするカセットが単一の箇所に挿入されたことをIn situ fluorescent hybridization(FISH)によって確認した。このDNAカセット内の配列を配列特異的エンドヌクレアーゼCRISPR/Cas9によって切断すると、mCitrineを発現した細胞が数％生じ、そのような細胞は姉妹染色分体の融合を引き起こしていることを明らかにした。この結果は、染色体融合を誘導した上で可視化するという当初のアイデアが実現可能であることを示している。
2.M期停止時のテロメア脱保護のメカニズム解明のため、BLMヘリケースを阻害した細胞においてM期テロメア脱保護が抑制されるという予備実験結果を確認し、さらにこの細胞にshRNAに対して耐性となるBLMを発現させたレスキュー実験を行い、確かにBLMの阻害によって表現型が引き起こされていることを明らかにした。またヘリケース活性ドメインに点変異を導入したBLMも表現型をレスキューしたことから、BLMのヘリケース活性はM期テロメア脱保護に必要ないことが明らかとなった。よってこの結果は、BLMと相互作用する他の因子がテロメア脱保護に関わる可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
望んだ種類の染色体融合を人為的に誘導し、さらにその細胞を可視化するという当初のコンセプトを計画に沿って実現した。このような系の開発は前例がなく、期待した成果が得られていると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.開発した姉妹染色分体融合の融合系においては、融合の誘導効率が全細胞の２％程度と比較的低く、今後のライブセルイメージングによる解析における困難が予期される。そこで誘導効率を上昇させることを目指す。これまでの成果により、開発した系における姉妹染色分体融合は、切断部位のマイクロホモロジーを利用して行われていることが示唆されている。そこで、予め比較的長いマイクロホモロジー配列をDNAカセットの姉妹染色分体融合ポイントに組み込んでおき、融合の効率が上昇するかを確認する。また融合した染色体のみを可視化するために、ヌクレアーゼ活性を失ったCas9と蛍光タンパク質との融合タンパクを利用した系を開発し、融合した染色体がどのような挙動を示すかを解析する。
2.M期テロメア脱保護解析においては、BLMのヘリケース活性が必要ないという結果が得られたことから、BLMと相互作用する因子（TOP3A, RAD51, FANCM, ATMなど）がM期テロメア脱保護に関与する可能性を引き続き解析する。
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