2018 Fiscal Year Annual Research Report
The mechanism of chromosome instability in telomere crisis
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16H06176
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
林 眞理 京都大学, 白眉センター, 特定助教 (90761099)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | テロメアクライシス / テロメア脱保護 / M期停止 / 細胞周期 / BLM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転座や欠失など種々の染色体構造異常の中でも、染色体融合は最も危険な異常の一つである。染色体融合がどのように染色体の異常を引き起こすかについては、様々なモデルが提唱されている。しかし、どの程度の種類と数の染色体融合が、どの程度の時間を経てどのような異常を引き起こすのかについては、よく分かっていない。そこで本研究計画では、１つの姉妹染色体分体の融合を可視化できる細胞系を構築し、細胞の運命を継時的に解析することを目的とした。
前年度までに姉妹染色体分体融合を可視化できる細胞システム（Sister chromatid Fusion Visualization system: FuVis）の構築に成功し、FuVisを用いたライブセルイメージング観察によって姉妹染色体分体融合の運命を追跡した。その結果、１つの姉妹染色体分体融合によって、微小核という染色体異常が生じていることが示唆された。しかしながら、CRISPR/Cas9による染色体の切断、DNA修復、mCitrineの発現の効果など、複数のパラメータの中で、本当に姉妹染色分体こそが、微小核の形成に影響を与えているのかを解析する必要があった。そこで本年度は、動画から得られたデータをさらに詳細に解析するため、京都大学白眉センターの加賀谷白眉との共同研究を開始した。これまでの解析から、階層ベイズモデルを構築し動画データをあてはめることによって、細胞の個性、染色体切断、姉妹染色分体融合、時間経過による蓄積効果など種々のパラメータの中から、姉妹染色体分体融合こそが微小核の形成に寄与していることを突き止めた。本研究成果はbioRxivにアップロードし、論文投稿段階にある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画では、単一の姉妹染色分体融合をX染色体に引き起こし、さらに蛍光タンパク質であるmCitrineの発現を協調して誘導することで、そのような姉妹染色分体融合を持つ細胞をラベル可能な系の構築、並びにその系を利用した姉妹染色分体融合の運命解析を目的としている。実際にそのような系を構築し、ライブセルイメージングによる動画解析を行なった際に、融合を持たないコントロールの細胞においても、実に多様な細胞周期異常が観察されることが明らかとなった。つまり、CRISPR/Cas9の切断による影響や、mCitrineの発現、細胞の個性など、様々なパラメータを考慮に入れた統計解析が必要であると考えられた。そこで、当初の計画を修正・展開し、京都大学白眉センターの加賀谷助教との共同研究を開始した。数々のモデリング、統計解析を経て、姉妹染色分体融合こそが、微小核形成に影響を与える唯一のパラメータであることを突き止めた。さらに微小核を持つ細胞は、その後の細胞周期が遅延し、細胞周期異常を生じる可能性が上昇することも明らかとした。これらの解析は当初予定していなかったものの、姉妹染色分体融合の運命を解明するという目的に鑑みて、研究の質を上昇させたと考えている。
さらに、M期テロメア脱保護機構の解明に関する研究においては、BLMヘリケース形成する複合体、BTR複合体の全ての構成因子であるBLM、RMI1、RMI2、TOP3AがM期テロメア脱保護に必要であることを突き止め、さらにTOP3Aの酵素活性こそがこの反応に必要であることを示唆する結果を得ている。よって本研究計画はおおむね順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度においては、まず、これまでに得られた成果の国際誌への発表を目指す。さらに、FuVis系において得られた結果をさらに展開させるべく、微小核を生じた後の運命を解析する。姉妹染色分体をもち、mCitrineを発現する細胞をフローサイトメトリー技術によって回収し、１細胞でのゲノムシークエンスに挑戦する。これによって、姉妹染色分体を生じたX染色体、並びにその他の常染色体が受けた影響を網羅的に解析する。また蛍光in situハイブリダイゼーションも行い、染色体の異常を顕微鏡で可視化することで染色体構造異常を解析、シークエンスの結果と相乗的に用いることで、姉妹染色分体融合の運命を明らかにする。また異なる染色体が融合した際に赤色に発光する細胞の構築にも着手し、異なる種類の染色体融合が細胞に与える影響の解析を試みる。
M期テロメア脱保護機構の解明を目指した研究においては、TOP3Aの酵素活性の必要性についてさらに解析を進める。また、BLMとテロメアタンパク質であるTRF1が結合することが報告されているため、BLMとの結合に必要なTRF1のアミノ酸に変異を入れ、M期テロメア脱保護にBLM-TRF1の結合が関与している可能性について解析する。これらの研究成果から、M期テロメア脱保護の分子機構についてのモデルを構築し、当該成果を国際誌に発表する。
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Research Products
(10 results)
