2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of N-acetylglucosaminyltransferase II, an enzyme essential for complex-type N-glycan biosynthesis
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16H06847
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
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| Project Period (FY) |
2016-08-26 – 2018-03-31
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| Keywords | Ｎ結合型糖鎖 / 糖転移酵素 / 複合型糖鎖 / カイコ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はヒトおよびカイコ由来Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素II（GnTII）の構造機能相関を目的とし、大量発現および精製方法の検討、また酵素学的諸性質の解析、Ｘ線結晶構造解析のため結晶化条件の検討を行った。
１）ヒトGnTIIについては、N末端またはC末端側にHisタグおよびFLAGタグを付加し、N末端側領域を数段階欠損させた変異体を構築し、カイコ－Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV） バクミド発現系により可溶性タンパク質として発現させた。2段階のアフィニティークロマトグラフィーにより、カイコ幼虫の体液から簡便に精製することができた。この系により、カイコ幼虫数十頭の体液からミリグラムオーダーで精製タンパク質を得ることが可能になったが、有望な結晶は得られなかった。ヒトGnTIIに付加している糖鎖を切断し活性を測定したところ、切断前と比較して至適温度、pH、温度安定性に顕著な差が見られなかったことから、糖鎖は酵素活性や安定性に重要でないことが明らかになった。
２）カイコGnTIIも同様にカイコ－BmNPVバクミド発現系により、体液に分泌発現させ、ポリエチレングリコール沈澱と1段階のアフィニティークロマトグラフィーにより単一に精製した。本酵素の基質特異性はヒトGnTIIと同様に厳密であり、温度依存性、pH依存性、金属イオン依存性はいずれもヒトGnTIIや他のオルソログと類似していた。カイコGnTIIはヒトGnTIIより多くのＮ結合型糖鎖が付加しているが、糖鎖の有無は酵素活性に影響しないことがわかった。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Presentation] 哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムの分子機構2018
Author(s)
伏見 圭司, 宮崎 剛亜, 山本 達郎, 竹田 百花, 桑崎 勇人, 中嶋 隆浩, 榎本 元, 池内 昌彦, 朴 龍洙, 佐藤 守俊, 成川 礼
Organizer
日本農芸化学会2018年度大会
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[Presentation] 哺乳類内在色素結合型シアノバクテリオクロムを基盤とした汎用的光遺伝学ツールの開発2017
Author(s)
伏見 圭司, 竹田 百花, 山本 達郎, 宮崎 剛亜, 桑崎 勇人, 中嶋 隆浩, 榎本 元, 池内 昌彦, 朴 龍洙, 佐藤 守俊, 成川 礼
Organizer
藍藻の分子生物学2017
