分裂期キナーゼＡｕｒｏｒａ Ｂの活性制御の破綻による染色体不安定性獲得機構の解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16J03050
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 迫 洸佑 公益財団法人がん研究会, がん研究所 実験病理部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Keywords: 染色体分配 / CPC / HP1 / INCENP / Aurora B

Outline of Annual Research Achievements

正確な染色体分配を担う重要な分子として、染色体パッセンジャー複合体(CPC; Chromosomal Passenger Complex)が知られている。CPCはM期キナーゼであるAurora Bを含み、INCENP(足場タンパク)、Survivin, Borealinの4つのタンパク質から成る複合体である。また、長大な天然変性領域(IDR)をもつ足場タンパクのINCENPには、HP1(Heterochromatin Protein 1)が自身のChromo shadow domain (CSD)を介して結合することも知られている。その結合の生理的意義は長らく不明であったが、近年我々は、その結合がCPCの正常な活性維持に必須であることを明らかにした[Abe et al., 2016]。加えて、Aurora BキナーゼによるHP1のヒンジ領域へのリン酸化が、HP1のCPCに対する安定的な結合を保障していることも明らかとなり、HP1/CPC相互作用における正のフィードバックループ機構の存在が示唆されていた。
そこで本研究員は、HP1によるCPC活性制御機構の解明を目標に掲げて研究を遂行している。なお、一般にIDRは他分子との相互作用よる構造変化が起こりやすい領域であることが知られており、これを踏まえて構造生物学的な観点からその解析を進めることにした。本年は、まず等温滴定カロリメトリー(ITC)解析によるHP1/INCENP相互作用領域の再検証を行い、新たな相互作用領域の特定に成功した。また、試験管内(in vitro)における構造生物学的解析の準備段階として、INCENP/Aurora B二者複合体、およびCPC複合体の各発現系の構築も行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1) ITC解析によるHP1/INCENP最小相互作用領域の特定
これまで、HP1はCSDを介してINCENPのPxVxL/Iモチーフに結合することが知られていた。しかし我々の過去の研究から、Aurora BによるHP1ヒンジ領域へのリン酸化を介した新たな結合様式の存在も示唆されていた。よって、HP1/INCENP相互作用領域の再同定を行うべく、ITCによる解析を行った(横浜市立大学 西村善文教授の協力のもと実施)。その結果、PxVxL/Iモチーフ以外のHP1新規相互作用領域の特定に至り、かつ、その領域はHP1の機能的な結合を保障する役割をもつ可能性が高いことも判明した。
(2) INCENP/Aurora B二者複合体、およびCPC複合体組換えタンパクの各発現系構築
INCENPは900アミノ酸を超えるタンパクであるため、HP1結合によるCPC制御機構を考える上で、INCENP全長あるいはCPC複合体を用いた包括的な解析が必須である。特に、我々の過去の研究から、INCENP/Aurora Bへテロ二量体とHP1の3者だけでAurora Bの活性上昇が認められ、かつ、それは従来のAurora B活性化機構とは異なっている可能性が高いことも分かっていた。加えて、INCENPはそのほとんどが長大なIDRから構成されており、HP1結合によるINCENPの構造変化がCPCの活性制御に寄与している可能性が十分に考えられた。そこで、INCENPのIDRとCPC活性の関係性を試験管内(in vitro)解析にて調べるため、その前準備としてINCENP/Aurora Bへテロ二量体(大腸菌発現)、およびCPC複合体 (Sf9細胞発現)の野生型組換えタンパク発現の条件検討を行い、その発現系の構築に至った。

Strategy for Future Research Activity

(1) 液中におけるINCENPおよびCPCの挙動解析
INCENP/Aurora Bへテロ二量体およびCPC複合体の液中での挙動(IDRの構造変化を含む)を観察するため、高速原子間力顕微鏡(High-speed AFM)による解析を予定している(金沢大学 古寺哲幸准教授の協力のもと実施)。また、ITCで明らかになった新領域、およびIDRの各欠損変異体INCENP組換えタンパクを作製し、他のin vitro解析(HP1結合アッセイやリン酸化アッセイ)を駆使した多角的なCPC活性化機構の解明を行う予定である。
(2) 細胞内におけるHP1/INCENP新規相互作用領域の生理的意義の解析
ITC解析で明らかになった新規相互作用領域、およびIDRの欠損変異体INCNEPの発現細胞を現在作製中である。この細胞において、我々が過去に明らかにしたHP1非結合型CPCの機能低下の再現性を新領域欠損変異体にて検証することに加え、CPCの機能維持とIDRの関係性を調べるべく、IDR欠損変異体の表現型解析を行う予定である。
(3) HP1/INCENP相互作用領域のアミノ酸レベルでの解析
ITC解析にて明らかになったINCENPのHP1新規結合領域について、現在はアミノ酸残基レベルでのより詳細な相互作用部位をNMR分光法によって解析中である(横浜市立大学 西村善文教授の協力のもと実施)。これによりさらに重要度の高いアミノ酸残基を特定し、上記の変異体解析をより詳細に行う予定である。