2016 Fiscal Year Annual Research Report
リードスルー作用に着目した新規高活性ネガマイシン誘導体の創製とその作用機構の解明
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16J08454
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
濱田 圭佑 東京薬科大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | ネガマイシン / リードスルー / ナンセンス変異 / 遺伝病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝性疾患の5～20%は、ナンセンス変異により構造遺伝子中に未熟終止コドン (Premature Termination Codon; PTC) が生じることで、機能を有する完全長タンパク質が生合成されず発症する。しかし近年、翻訳過程において、このPTCを読み飛ばし（リードスルー）、完全長タンパク質を発現させる低分子化合物（リードスルー化合物）が、ナンセンス変異性疾患の治療薬候補化合物として注目を集めている。遺伝性疾患の画期的な治療法は確立されていないため、これら化合物による薬物治療開発に大きな期待が寄せられている。
(+)-Negamycin (1) は1970年に放線菌より単離同定され、近年リードスルー活性を有すると報告されたジペプチド様抗生物質である。これまで我々は、1を基盤とした遺伝病治療薬創製研究を展開してきており、医薬候補化合物の獲得のため構造活性相関研究を実施した。その結果、これまで生物活性未知であったネガマイシン関連天然有機化合物3-epi-deoxynegamycin (2) およびleucyl-3-epi-deoxynegamycin (3) が高いリードスルー活性を有することを明らかにした。さらに3のβ－アミノ酸の側鎖炭素数を1つ減じた高活性誘導体TCP-112 (4) の独自開発にも成功している。本研究は、(A)さらなる高活性誘導体を創製するべく、3および4をリード化合物とし構造最適化、及び各種官能基の置換を行うことで医薬候補化合物を獲得するとともに (B)未だ同定されていないネガマイシンの真の分子標的とその詳細な認識部位の同定、及びリードスルー作用の詳細な機構を明らかにすることで、難治性遺伝性疾患における過去に例のない新規治療戦略の確立を目指すものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は、TCP-1109 (5) を基にした構造活性相関研究を展開した。初年度計画書に記載している、3位アミノ基に着目した構造変化によるさらなる高活性誘導体の獲得を目的として、新規アミノ酸ユニットの合成に着手した。さらに、29年度実施予定であった、既存のカルボン酸部位誘導体TCP-182 (6) をはじめとする種々のエステル型誘導体の構造を融合したハイブリッド体 (7) の合成を行うことで、高活性誘導体の獲得を模索した。しかしながら、TCP-1109 （5）のC末端にエステル化を施した誘導体 (7) においては、リードスルー活性の向上は見られなかった。以上の結果より、3位アミノ基に有する直鎖脂肪鎖ユニットがエステル誘導体のエステラーゼ認識性を低下させ、活性本体であるTCP-1109 (5) への変換頻度を低下させることで、リードスルー活性が減弱した可能性が示唆された。
一方、平成30年度に計画しているネガマイシン結合部位及びその活性発現機構の解析研究の遂行に向け、本年度より酵母 （多剤超感受性酵母株：12geneΔHSR） を用いた遺伝学的解析研究にも着手した。本年度では、アデニン合成遺伝子 （ADE2） 中に各種PTC変異を有する酵母株による、定性的なリードスルー活性評価系の構築を計画した。即ち、化合物に活性が無い場合、変異株は赤色を呈す一方で、活性が有る場合、白色を呈することで当該活性の有無を定性的に判断できる評価系の構築を目指した。検討の結果、12geneΔHSRへN末端欠損ADE2遺伝子断片を含む環状ベクターを導入した後、カウンターセレクションを行うことにより、各種ナンセンス変異含有酵母株を構築することに成功した。さらに、本変異酵母株を用いてネガマイシン誘導体を評価した結果、2種の化合物において白色の呈色が認められ、活性発現を定性的に確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度に構築した各種ナンセンス変異含有酵母株を用い、ネガマイシン誘導体の真の結合部位並びに詳細なリードスルー作用発現機構の解明を目的としたケミカルバイオロジー研究を展開する。すなわち、①昨年度構築したADE2_PTC変異酵母株を用い、ネガマイシン誘導体に対するリードスルー耐性変異株を単離後、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析により遺伝子変異箇所を同定することで、耐性付与に関連する因子の抽出を図る。続く遺伝学的解析によりネガマイシン誘導体の結合部位およびその作用発現機構の解析に迫る。さらに、②昨年度構築した定性的リードスルー評価系に加え、定量が可能な評価系を構築するべく、LacZ遺伝子内にナンセンス変異を導入した新規プラスミドの獲得並びに酵母株の構築を行う。
一方、28年度に実施した構造活性相関研究で得られた情報を基盤として、ネガマイシンの分子標的及びその詳細な作用機序の解明を目的として、③TCP-112の3位アミノ基誘導体において化学プローブ化が可能な官能基、修飾部位を抽出し、光親和性標識を導入した誘導体を合成する。分子設計としては、誘導体の3位アミノ基に対しベンゾフェノン及びトリフルオロメチルジアジリンの導入を計画している。光反応性官能基に加えクリックケミストリーを適用できるアルキン構造を導入した誘導体を合成することで標的分子の同定、結合部位の探索が可能となる。合成した化学プローブは培養細胞を用いたin vitro評価系及び無細胞タンパク質合成評価系にてリードスルー活性を評価する。有望な化学プローブについては、リボソームへの標識後、標的がタンパク質の場合、アルキル鎖に対するHuisgen環化付加反応を用いたビオチン標識を行い、続く酵素標識ストレプトアビジンを用いたウエスタンブロットによる光標識検出を介して、質量分析により分子標的の同定を試みる。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] Construction of the multidrug-sensitive yeast strain for elucidating the mechanism of the readthrough activity of (+)-negamycin and its analogues2016
Author(s)
Hamada, K., Taguchi, A., Kobayashi, M., Takayama, K., Usui, T., Hayashi, Y.
Organizer
2016 ASCB Annual Meeting
Place of Presentation
Moscone Center, California
Year and Date
2016-12-03 – 2016-12-07
Int'l Joint Research
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[Presentation] Modification of Carboxylic Acid Part in Negamycin Analogues and Its Effect on Readthrough Activity.2016
Author(s)
Hamada, K., Taguchi, A., Murakami, S., Kobayashi, M., Takayama, K., Hayashi, Y.
Organizer
The 14th Chinese International Peptide Symposium & the 5th Asia-pacific International Peptide Symposium
Place of Presentation
南京、中国
Year and Date
2016-07-04 – 2016-07-07
Int'l Joint Research
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