2017 Fiscal Year Annual Research Report

多様なバイオマスを構成する多糖類を分解できる微生物の基質の識別・認識機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16J08791
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	油屋駿介京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2016-04-22 – 2019-03-31
Keywords	メチルトランスフェラーゼ / クロストリジウムセルロボランス / 宿主ベクター系 / 経時的プロテオーム
Outline of Annual Research Achievements	1.　C. cellulovoransの宿主ベクター系の開発 Clostiridium cellulovoransの宿主ベクター型の開発を行った。大腸菌DH10β株ではDNAメチラーゼ活性を確認することが出来なかったので、大腸菌由来のメチルトランスフェラーゼdamまたはdcm両方を欠損しているIBL21(DE3)株を用いてメチルトランスフェラーゼを発現した。しかし諸条件を検討した結果、IBL21(DE3)株においてもメチルトランスフェラーゼの活性は確認できなかった。大腸菌の宿主やメチルトランスフェラーゼ配列の最適化法を検討中である。 2. C. cellulovoransの経時的プロテオーム解析以前のClostridium cellulovoransの比較プロテオーム解析の結果から本微生物が上清に存在する基質に応じて代謝タンパク質や基質の認識に関わるタンパク質群を大きく変動させていることが明らかになった。一方、C. cellulovoransがこれらの多糖基質の分解・代謝の際に、どのようにして経時的に分泌タンパク質と細胞タンパク質を変動させていくメカニズムは未だ明らかになっていない。これを明らかにするためにC. cellulovoransの経時的プロテオーム解析を行う。今年度は経時的プロテオームのためにそれぞれの多糖基質における生育曲線を作成し、サンプリングポイントを決定した。また分泌タンパク質と細胞タンパク質それぞれをサンプリングポイントから採取し、プロテオームサンプルを調整した。得られたサンプルをTMT labelによってラベル化した後にnano LC-MS/MSで分析しプロテオーム解析を行った。現在統計的解析を行い、タンパク質の経時的な変動を追っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、C. cellulovorans由来のメチルトランスフェラーゼをいくつかの大腸菌株に発現させて活性を確認した。しかしどの株においてもメチルトランスフェラーゼ活性を確認することは出来なかった。また以前得られた比較プロテオーム解析の結果から、本微生物が上清存在する多糖群に応じて酵素群の適応している機構が明らかになった。これを明らかにするため、当初の計画に加えて経時的プロテオーム解析を行っている。
Strategy for Future Research Activity	来年度はC. cellulovoransの宿主ベクター型の開発を目指す。用いる配列や大腸菌株などを再度検討する。加えて、経時的プロテオーム解析のデータの統計解析を行う。