2016 Fiscal Year Annual Research Report
リポソームを用いたエキソソーム内ｍｉｃｒｏＲＮＡの高感度検出法の開発
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16J40215
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
津金 麻実子 中央大学, 理工学部, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2016-07-27 – 2020-03-31
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| Keywords | リポソーム / エキソソーム / RT-PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脂質二重膜小胞であるリポソームを用いた、エキソソーム中のmicroRNAを高感度に検出するシステムの構築を目的としている。方法としては、リン脂質から人工的に作製した閉鎖小胞であるリポソームにPCRの試薬を内包し、それをエキソソームと直接融合させた後、エキソソーム中のmicroRNAをPCRにより増幅し、生成物の蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察することで特定のmicroRNAを検出する。
1年目である本年度は、はじめにRT-PCR試薬を内包したリポソームの調製方法の検討を行った。PCR試薬としては逆転写反応とPCR反応を1チューブ内で行える1ステップのキットを用い、RNAはヒトのtotal RNA用いて、まずは内在性コントロールとなるmRNAのRT-PCRをリポソーム内で行う系を構築することとした。PCR試薬は塩濃度が高く、酵素など種々の試薬を含有すること、RT-PCRによる温度変化に耐えうる必要があることなどから、リポソーム作製に最適なバッファーや脂質の選択に難航した。検討の結果、エキソソームとの融合に適した1枚膜のリポソームを形成する界面通過法を用いて、Taq Manプローブ検出系のRT-PCR試薬を内封するリポソームの作製に成功した。また、このリポソームをマイクロチューブ内でリアルタイムPCR装置を用いてRT-PCRしたところ、蛍光顕微鏡観察によってリポソーム内でPCR産物に由来する蛍光強度の増加が観察でき、リポソーム内でのmRNA増幅が確認された。内封するtotal RNAの量や検出するmRNAの種類を検討した結果、リポソーム内に目的とするmRNAのコピー数が数～数十個であっても検出可能であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PCR試薬を内封するリポソームの作製において、バッファーの塩濃度や含有試薬の成分に起因すると考えられる作製効率の低さ、mRNA増幅が確認されるリポソームの割合が低さから、バッファーや脂質の種類、テンプレートとなるtotal RNA濃度、リポソーム調製方法（界面通過法、エレクトロフォーメーション法）、PCR増幅産物の検出方法（プローブ法、SYBR Green Ⅰ法）など種々の条件を検討したため、予想よりも時間を要してしまった。しかし、リポソームの作製条件や合成mRNAを用いた適切なテンプレート濃度が明らかとなってからは研究が進展し、リポソーム内RT-PCR法を確立するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まずリポソームとエキソソームの融合条件を検討する。細胞やリポソーム同士、細胞とリポソームの融合方法を参考にしてPEG法や電気刺激融合法を試みて、各条件における融合率を把握する。
また、将来的には、リポソームとエキソソームの融合後のリポソーム内PCRの蛍光観察を容易にするため、マイクロチャンバーにリポソームを整列、固定することを目指しているので、そのチャンバーデザインを検討し、リポソームのサイズに応じたPDMS製のマイクロチャンバーを作製する。
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