2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA結合性蛍光プローブによるHDAC活性のイメージング法の開発
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16K01933
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
蓑島 維文 大阪大学, 工学研究科, 助教 (20600844)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / HDAC / エピジェネティクス / 蛍光イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではがん等の疾患発症に関連する酵素、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の細胞内における活性を蛍光イメージングすることを目的とする。蛍光イメージングにあたり、HDACの基質であるアセチルリジンとDNA結合色素から構成される蛍光プローブを用いる。この蛍光プローブは基質の脱アセチル化に伴い、プローブの電荷状態が変化することでDNAに結合し蛍光が上昇する性質を有している。従って細胞に投与後HDACと反応して核内のDNAに結合し、蛍光シグナルが得られることが期待される。
本年度では細胞内HDAC活性をイメージングするために、蛍光プローブの基質部分、特にアセチルリジンの数の影響について検討した。これまでに用いてきたアセチルリジンが1ヶ所しか導入されていないプローブではHDAC反応後の蛍光強度の上昇比が１０倍弱であり、より精度良く高感度に検出するためには改善の余地があった。そこで基質に含まれるアセチルリジンの数を増やしたプローブを設計、合成した。DNA結合能を比較するために同じだけリジンの数を増やしたプローブも合成した。リジンの数を増やすことで従来のプローブより強いDNA結合能を示した一方、リジンのアセチル化によりDNA結合能が失われることが分かった。そこで、プローブをDNA、HDACと共に混合し、HDAC反応を蛍光測定によりモニタリングしたところ、従来よりも大きな蛍光強度の上昇を示した。さらに新たに合成したプローブを用いることで、HDAC検出感度の向上を達成し、より短時間での阻害剤評価へと応用できることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度実施した基質部分における検討により、従来の蛍光プローブよりも高いOFF-ON比でHDAC活性を検出することが可能となった。これは本蛍光プローブ基質において、正電荷を有するリジン残基の数がDNA結合能に大きく寄与していることに着目し、新たな基質を有するプローブの開発に着手した結果である。実際に、リジン残基の数を増やすごとにDNAとの結合能の上昇が融解温度の測定により観察された。一方でこれらのリジン残基をアセチル化したプローブではDNA結合能が失われることを確認した。したがって、アセチル化している状態ではDNAに結合せず蛍光が抑えられ、複数箇所における脱アセチル化によりさらにDNA結合能が強まり、蛍光強度がより大きく上昇することが予想された。これらの結果を受けて、複数のアセチルリジンを基質に導入したプローブを合成し、DNA存在下においてHDAC活性の蛍光検出を行った。その結果、従来８倍程度であった蛍光上昇比がさらに増大し、20倍以上にまで達することが示された。また、これまでのプローブと同様に、基質はHDACと速やかに反応し10分程度で蛍光強度の飽和が見られ、脱アセチル化反応が完了していることも示された。この成果は、本研究の目的としているHDACの生細胞活性イメージングのためには重要な知見であり、今後の生細胞におけるHDAC活性をより鮮明に可視化できるものと期待できる。以上のことから、現在の研究進捗状況としてはおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内HDAC活性をイメージングするために、さらなる蛍光プローブの基質部分の検討を行う。具体的には阻害剤の構造をHDAC基質に導入した蛍光プローブライブラリーを作製し、細胞から抽出したHDACとの反応により蛍光シグナルが大きく上昇するものを選択する。阻害剤の化学構造に共通した特徴として、HDAC酵素活性を阻害するヒドロキシルアミンと、触媒ポケット入口周辺のアミノ酸と相互作用するための芳香族化合物が導入されている。そこで阻害剤のヒドロキシルアミン部分をアセチルリジンに置き換え基質とし、DNA結合色素と連結した化合物ライブラリーを設計・合成する。
合成した蛍光プローブのライブラリーを用い、細胞から抽出したHDACとの反応性を評価する。培養細胞の核抽出液を蛍光プローブと混合し、蛍光を検出するために反応後にDNAを加え、マイクロプレートリーダーを用いてハイスループットに検出する。基質部位によりDNAに対する結合能が化合物毎で異なることが想定されるため、添加するDNAの濃度を変えながら検出する。本実験の遂行により、核抽出液との反応前後で蛍光強度が大きく上昇した基質を選択し、核内HDACと効率よく反応できる基質部分の最適化を行う。
また、比較対照として脱アセチル化後の生成物であるリジン型の蛍光プローブを合成し、蛍光プローブの脱アセチル化によるDNA結合能と蛍光特性の影響を調べる。DNA結合に関しては、二本鎖DNAの融解温度（Tm）を測定し、蛍光プローブ添加による上昇値を比較する。蛍光特性に関しては、DNA存在下におけるリジン型とアセチルリジン型の蛍光強度を比較していく。
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| Causes of Carryover |
高価な合成用試薬、酵素を次年度に購入することとしたため、若干の差額が生じた。研究経費としてはおおむね予定通り遂行できている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
核内移行に優れた色素の合成用試薬および酵素反応用の試薬として使用する予定である。
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