2017 Fiscal Year Research-status Report
好アルカリ性放線菌に由来する各種GHファミリー18キチナーゼの性質検討と機能改変
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16K05839
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
中村 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (50227899)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | GH18キチナーゼ / 好アルカリ性放線菌 / Nocardiopsis sp. / マルチドメイン酵素 / キチン結合ドメイン / キチナーゼ挿入ドメイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キチナーゼ生産菌として分離した好アルカリ性放線菌Nocardiopsis sp. F96株のゲノム上には，4つの糖質加水分解酵素（GH）ファミリー18キチナーゼ遺伝子ホモログ（chiF1，chiF2，chiF3およびchiF4）がコードされている。これら4つのキチナーゼは互いにドメイン構成等が異なっていた。たとえば，ChiF1はGH18触媒ドメイン（CatD）のみからなるシングルドメイン構造をとり，CatD 中にはキチナーゼ挿入ドメイン（CID）を含まない。一方で，ChiF3はマルチドメイン構造をとり，糖質結合モジュール（CBM）ファミリー2キチン結合ドメイン（ChBD），フィブロネクチンタイプⅢ様ドメイン（FnIIID）および CID を含むGH18触媒ドメインから構成される。これまでに，chiF１ および chiF３ 遺伝子のクローニングと大腸菌における発現が行われた。His-tag 精製した組換えChiF1 および ChiF3の性質比較の結果，両酵素の反応至適pHに大きな差異があることが明らかとなった。
ChiF3 の ChBD-FnIIID および CID 領域の機能解明を目的とし，ChiF1 に ChBD-FnIIID または CID 領域を付加したキメラ酵素，ならびに ChiF3 の CID 領域を欠失した欠失型酵素を調製し，野生型 ChiF1 および ChiF3 との詳細な性質比較を行った。その結果，ChBD-FnIIID 領域をもつ酵素はもたない酵素に比して，①アルカリ性領域での相対活性が高まる，②不溶性キチン結合能が極めて高い，③不溶性キチン基質を好んで分解すること，などが示された。また，CIDの存在によりエキソ型の切断様式が強まることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
好アルカリ性放線菌Nocardiopsis sp. F96株が生産する 4つのGH18キチナーゼ遺伝子ホモログ（chiF1，chiF2，chiF3及びchiF4）のうち，chiF2およびchiF4遺伝子のクローニングと大腸菌BL21(DE3)株における発現を試みたが，組換え酵素の取得には至らなかった。
そこで，ChiF3 の ChBD-FnIIID および CID 領域の機能解明を目的とし，ChiF1 に ChBD-FnIIID および CID 領域を付加したキメラ酵素BF-ChiF1 および ChiF1/CID，ならびに ChiF3 の CID 領域を欠失した欠失型酵素 ChiF3/ΔCIDを調製し，野生型 ChiF1 および ChiF3 との詳細な性質比較を行った。その結果，ChBD-FnIIID 領域をもつ酵素（BF-ChiF1 および ChiF3）はもたない酵素（ChiF1）に比して，アルカリ性領域での相対活性が高まる一方，酸性領域での相対活性は低下した。また，ChBD-FnIIID 領域をもつ酵素は不溶性キチン結合能が極めて高かった。さらに，ChBD-FnIIID 領域をもつ酵素は不溶性キチン基質を好んで分解し，もたない酵素は可溶性キチン基質を好んで分解する傾向にあることが示された。そして，CID をもつ酵素（ChiF1/CID および ChiF3）はもたない酵素（ChiF1 および ChiF3/ΔCID）に比して，(GlcNAc)6 基質からの反応産物として 3 糖が生成しにくくなっていた。これより，CID はエキソ型の切断様式を強める働きがあることが示唆された。
平成28年度からの継続課題である ChiF2 および ChiF4の性質検討には至っていないものの，ChiF3 に存在する CID の機能を明らかにするという重要な知見が得られており，研究はおおむね順調に推移していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も chiF2 および chiF4 遺伝子の大量発現に継続して取り組む。組換え ChiF2 および ChiF4 の精製・性質検討を行い，ChiF1 および ChiF3 との類似点・相違点を明らかにする。
ChiF3 に存在する CID はエキソ型の切断様式を強める働きがあることを示唆する結果が得られているが，明解な結果とは言い難い。先行研究によれば，CID は細菌のエキソキチナーゼに見られる構造で，基質と相互作用するクレフトを深くすることでエキソ型の切断様式を獲得すると考えられているが，プロセッシビティとの関連を含め，不明な点が多く残されているのが現状である。今後は，研究対象を他のキチナーゼホモログにまで拡張し，GH18 キチナーゼに含まれる CID の普遍的役割を調べていく。すなわち， CID（および ChBD）と酵素のプロセッシビティとの相関関係を明らかにする。
より具体的には，当研究室で既に遺伝子クローニングと組換え酵素の性質検討が行われている，好アルカリ性 Bacillus sp. J813 株由来 GH18 キチナーゼ ChiJ も研究対象に加える。ChiJ は GH18 CatD，FnIIID および ChBD からなるマルチドメイン酵素であり，CatD 中には CID が存在する。ChiJ の大腸菌における生産効率は高く，組換え ChiJ の比活性は ChiF1 や ChiF3 に比してはるかに高い。F96 株由来 ChiF1 ～ ChiF4 以外に ChiJ も研究対象に加えることで，研究の普遍性が高まるだけでなく，研究の加速も期待される。
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| Causes of Carryover |
（次年度使用額が生じた理由）
平成28年度からの繰越金額の影響が大きい。また，平成29年度はキメラ酵素や欠失型酵素を用いた小規模な性質検討を行ったため，当初予定していた大量調製が可能なニッケルキレートカラム（モノリスカラムなど）の導入に至らなかったことも理由の一つである。
（使用計画）
平成30年度は，研究対象を他のキチナーゼホモログにまで拡大する。多種類の組換え酵素の精製の効率化に配慮し，モノリスカラムなど，大量調製が可能なニッケルキレートカラムの導入を計画している。
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Research Products
(3 results)
