2017 Fiscal Year Research-status Report
改良型トランスグルタミナーゼの近接依存反応を利用した複合タンパク質フィッシング法
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16K06865
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
後藤 猛 秋田大学, 理工学研究科, 教授 (10215494)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | トランスグルタミナーゼ / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究は，基質特異性が低く反応性に富むStreptomyces mobaraensis 由来トランスグルタミナーゼ（TGase）に改良を加えたもの（iTGase）を自身の触媒作用によって既知タンパク質（Bait：餌）に結合させ，得られたBait連結iTGaseのBaitに相互作用する未知タンパク質（Prey）をiTGaseの近接依存反応により蛍光標識して同定する新規なフィッシング法を開発することを目的とする。
TGase反応性の高いリジン含有ペプチド（-K）およびグルタミン含有ペプチド（-N）の付加する位置を当初計画のN末端からC末端側に変更し，さらにその間にHis-6タグを挿入したiTGase前駆体のcDNAを調製した。この構成により前駆体の活性化処理後も残るHis-6はiTGaseの精製を容易にし，さらに活性ペプチドとTGaseの間のスペーサーの役割も担うことが期待された。このDNAインサートを用い，BIC法によりBrevibacillus choshinensisを形質転換してそれぞれの分泌発現系を構築した。得られたiTGase前駆体をDispaseにより活性化し，Ni担持樹脂によりそれぞれ高活性なiTGase-K/-Nを得る事ができた。
一方，ラパマイシンを介して会合するFRBとFKBPを本フィッシング法の有効性を証明するための材料とし，これらにTGase高反応性ペプチドを付加したFKBP-Kおよび-Nを生産するための組換え大腸菌も構築した。
最後に，iTGase-NとiTGase-Kとの間の自己架橋生成物をSDS-PAGEによって分析した。その結果，iTGase-KおよびiTGase-NのTGase基質としての反応性はあまり高くない事が分かった。その理由として，His-6長さはスペーサーとして不十分であることが考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度の当初の計画は，iTGaseのC末側のTGase高反応性ペプチドの前にグリシンからなるペプチドをスペーサーとして挿入し，スペーサーの有無がiTGaseの自己架橋反応性に及ぼす影響を調べることであった。しかし，昨年度に実施したiTGase-Kおよび-Nの調製において，その前駆体発現後の精製タグとして市販ベクターのMCS上流側にあるHis-6配列を利用したが，前駆体の活性化処理によってHis-6がプロ配列と共に除去されてしまうため，活性化iTGase-Kおよび-Nの精製に課題が残っていた。そこで今年度，His-6をグリシンペプチドの代わりにTGase高反応性ペプチドとTGaseの間に挿入することにより，スペーサーと精製タグの両方の役割を果たすことを期待して研究計画を変更し実行した。その結果，このHis-6位置の修正はiTGaseの精製には有効であったが，スペーサーとしては不十分であることが示唆された。これがやや遅れていると判断される主な理由である。したがって，His-6に加えて長さの異なるグリシンペプチドも挿入したiTGase-Kおよび-Nを再調製し直す必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
C末側に，グリシンペプチド，His-6精製タグ，TGase高活性ペプチド（-Kおよび-N）を順に付加したiTGase前駆体のcDNAを調製し，これを用いてS. mobaraensisを形質転換してiTGase-Kおよび-Nの前駆体の分泌発現系を構築する。なお，グリシンペプチドの長さは6または12とする。この組換えS. mobaraensisを培養して得られるiTGase前駆体をDispaseにより活性化し，Ni担持樹脂により高活性なiTGase-Kおよび-Nを得る。
構築済みの組換え大腸菌を培養して得たFKBPを用い，iTGase-Kおよび-NのTGase基質としての反応性に及ぼすグリシン残基数の影響を調べて最適なスペーサー長を決定するとともに，iTGaseとの連結反応における選択性と収率の観点からTGase架橋反応条件を検討する。また，TGase高反応性ペプチドを付加したFKBP-Kおよび-NのiTGaseとの連結体形成についても調べる。
Preyを蛍光標識するための蛍光色素を付加したペプチドを委託合成する。上記で得られたFKBP連結iTGaseを用い，ラパマイシン存在下におけるFRBの蛍光標識反応を調べ，iTGaseを利用したPreyタンパク質フィッシング法の妥当性を明らかにする。なお，フィッシングしたPreyがFRBであることの確定分析はMALDI-TOF-MSにより行なう。
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| Causes of Carryover |
（理由）
申請額よりも減額されて配分されたことや，試薬等の消耗品の使用量が想定以上に多かった事から，初年度（平成28年度）に予定していた設備備品を購入することができなかった。これには既存の設備にオプションを追加すること等で対応したが，この設備備品とオプションの金額の差額分の一部が平成30年度使用額として引き続き繰り越される結果となった。
（使用計画）
学内共通機器であるMALDI-TOF-MSの専任管理者が退職により不在となったため，装置の精度が低下し満足な測定が困難となっている。本研究で目指すタンパク質の新規フィッシング法の有効性を証明するにはMALDI-TOF-MSによる測定が重要であることから，外部機関の装置を借用する必要がある。平成30年度繰越額の一部はこの追加発生する機器使用料に使用する予定である。また，新たに外国人博士研究員が研究メンバーに加わった。平成30年度において国際学会での発表を計画しており，自身および博士研究員の渡航旅費および学会登録料にも使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
