2017 Fiscal Year Research-status Report
成体脳海馬神経新生における酸感受性イオンチャネルASIC1aの役割
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16K06997
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
熊本 奈都子 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (30467584)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (20326135)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ASIC / 成体脳神経新生 / 神経回路形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当教室で作出した、ASIC1aの内在性プロモーターによりASIC1a、TagRFP（蛍光蛋白質）、HAペプチドタグの融合タンパク質(TagRFP-HA-ASIC1a)を発現するKIマウスを使って、成体脳海馬神経新生におけるASIC1a蛋白質発現の時空間的解析を行った。Tag RFPによる赤色蛍光シグナル強度が弱く、直接TagRFP-HA-ASIC1a蛋白質の発現を蛍光シグナルにより確認することはできなかったため、抗HA抗体を使った免疫組織染色を行った。海馬新生ニューロンの各ステージのマーカー（GFAP、nestin、Tbr2、DCX、NeuN）とHAの二重染色を行ったところ、DCX陽性細胞やNeuN陽性細胞の一部がHAシグナル陽性であり、少なくともDCX陽性細胞（未成熟ニューロン）とNeuN陽性細胞（成熟ニューロン）にはASIC1a蛋白質が発現していることが確認できた。昨年度行った、In situ hybridizationを用いたASIC1a mRNAの発現解析ではさらに初期の段階からmRNAの発現を認め、Whole-cell パッチクランプでも、初期の段階から酸刺激（pH5.0）によって誘発されるアミロライド（ASIC1aブロッカー）阻害性の内向き電流を記録したため、実際には神経幹細胞や神経前駆細胞（GFAP陽性細胞、nestin陽性細胞、Tbr2陽性細胞）にもASIC1a蛋白質が発現していると考えられる。神経新生の初期の段階では、ASIC1a蛋白質の発現量が免疫染色での検出感度以下であると考えられ、現在TSAシステムによるシグナル増感で初期の段階での蛋白質発現を確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで抗ASIC1a抗体の作製を試みてきたが、免疫組織染色でASIC1aを特異的に検出できる良質な抗体は今のところ作製できていない。そこで、ASIC1a蛋白質発現の時空間的解析を行うためASIC1a KIマウスを作出したが、目的どおりTagRFP-HA-ASIC1a蛋白質を発現することが確認できた。In situ hybridizationによるASIC1a mRNAの発現分布とも矛盾せず、野生型ASIC1a蛋白質と同じ発現分布を示すと考えられる。このマウスはASIC1aのコンディショナルノックアウトもできるため、今後は海馬神経新生におけるASIC1aの役割を電気生理学的解析と行動学的解析を使って解析する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ASIC1a蛋白質がDCX陽性細胞やNeuN陽性細胞に発現していることが確認できたため、既存の神経回路への新生ニューロンの組み込みにASIC1aが作用するか検討する。具体的にはASIC1a-shRNAを発現するレトロウイルスを成体マウス海馬歯状回に打ち込み、新生ニューロンでのASIC1aの発現を抑制して嗅内皮質由来の貫通線維と海馬新生ニューロンとのシナプス形成の開始時期と成熟度の変化を電気生理学的に調べる。また、今回作出したASIC1a KIマウスはCre/loxPシステムによりASIC1aのノックアウトもできるため、新生ニューロン特異的プロモーター制御下でCreを発現するトランスジェニックマウスと交配し、コンディショナルノックアウトマウスを作出して、記憶や空間学習能力を行動学的解析にて調べる。一方、mRNAレベルでは神経新生初期のニューロンでもASIC1aが発現していたため、神経幹細胞・神経前駆細胞の増殖へのASIC1aの影響をASIC1a KOマウスを用いて検討する。
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| Causes of Carryover |
ASIC1aノックインマウスを用いたASIC1a蛋白質発現の時空間的解析を行うのに十分なマウスを確保するのに、母親の喰殺や育児放棄が続き時間を要したため、マウス飼育費および組織学的解析に用いる試薬類や抗体の購入が予定より少なかった。
ASIC1aノックインマウスを用いた組織学的解析に必要な試薬、抗体や行動解析に必要な物品を購入する。また、マウスの飼育費に充てる。
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