2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K07081
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
石井 亜紀子 筑波大学, 医学医療系, 講師 (10400681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
喜納 裕美 (早下裕美) 日本医科大学, 大学院医学研究科, 助教 (60532728)
岡田 浩典 日本医科大学, 大学院医学研究科, 研究生 (80416271)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 免疫寛容誘導 / 組換えＡＡＶ / ヒト歯髄類似細胞 / 骨格筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
将来的なヒト遺伝子・細胞治療への応用を目標に，カニクイザルに免疫寛容を誘導し，免疫抑制剤を用いずに組換えAAVの骨格筋での発現を持続させる新規技術を開発するとともにその安全性と発現効率の改善を検討することを目的とした研究を継続した．
免疫寛容の誘導法として，当初、経口免疫寛容導入を予定したが，ヒト歯髄類似細胞(DC)を用いた免疫寛容誘導に切り替え実験を継続している．DCは間葉系幹細胞の一種で，間葉系幹細胞はナイーブＴ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導することで免疫寛容を誘導する．DCを免疫原との同時投与により，有効な免疫寛容を得ることができる．経口減感作と異なり，確実に投与できる点も利点であり，サルへの投与は本研究が最初である．今年度は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所霊長類医科学研究センター共同利用施設の研究課題としても採択され，順調に進捗している．
今年度はカニクイザル3頭に対し，DCとAAV9-CMV-LacZを経静脈投与し，その7日後に再度DCを投与し，翌日AAV9-CMV-LacZを筋肉内注射した．歯髄類似細胞は共同研究をしている国内製薬会社から供与を受けた．AAV9-CMV-LacZ投与量は，これまでにサルで検討した結果から1X10*13vg/muscleとした．投与は左右の上腕二頭筋，前脛骨筋の頚4か所に行った．LacZ遺伝子発現ベクター投与群2頭，コントロール（ベクター非投与）1頭を使用した．掲示的に末梢血リンパ球を採取し，抗原暴露後のインターフェロンγ産生能の減弱を調べることで免疫寛容の誘導を確認した．導入8，16，および24週後に筋組織の生検をおこない，42週後に安楽殺後のサンプリングを行った．同時に各時点で採血も実施し，安全性の確認を行った．現在，LacZの発現を解析中である．さらにAAV8-CMV-LacZ投与1頭，コントロール１頭の実験を継続している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所霊長類医科学研究センター共同利用施設の利用許可が得られず，ヒト歯髄類似細胞を用いた免疫寛容誘導に切り替えて実験を行ったが，今回は共同研究として採択され，サルの供与も受けられ，順調に実験を進めている．これまでにAAV9-CMV-LacZ2頭，コントロール１頭の実験が終了した．動物実験であるため経口減感作では投与の不確実性が否めなかったが，ヒト歯髄細胞の静注による免疫減感作に変更したため，確実に投与できた点が解析上も順調に結果を得られた要因の一つと考えられる．ヒト歯髄類似細胞を用いたサルへの免疫寛容誘導法については新規の試みであり，様々な遺伝子細胞治療の基礎実験すべてに応用可能な実験技術である．また，抜歯した歯髄などから取得可能であり，筋ジストロフィーのみならずこの方法の開発は他の遺伝性疾患への治療応用にも期待できる．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所霊長類医科学研究センター共同利用施設の共同研究としてヒト歯髄類似細胞を用いたサルへの免疫寛容誘導の実験を継続する．終了したAAV9-CMV-LacZ2頭，コントロール１頭のウエスタンブロット法および免疫組織化学法による解析を進める．AAV8-CMV-LacZ投与1頭，コントロール１頭の実験については平成30年4月11日に3回目の筋生検が終了し，9月に安楽殺後最終サンプリングを予定している．AAV9-CMV-LacZとAAV8-CMV-LacZの結果を合わせて論文化を予定している．
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| Causes of Carryover |
(理由）
骨格筋凍結に使用する液体窒素の費用が校費から差し引くこととなったため．また，国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所霊長類医科学研究センターでの生検時に使用する機材が予定より少なくて済んだため．
(使用計画）
引き続き行う実験で得られる生検筋の染色やスライドガラス購入の一部に使用する．
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