2017 Fiscal Year Research-status Report

Development of a method to directly introduce a chemically modified DNA cassette into the target region of a genome

Research Project

Project/Area Number	16K07208
Research Institution	Kazusa DNA Research Institute
Principal Investigator	中山学公益財団法人かずさDNA研究所, 技術開発研究部, チーム長 (30370927)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	ゲノムエンジニアリング / バイオテクノロジー / ゲノム改変技術 / 部位特異的組み換え酵素 / VCre/VloxP / SCre/SloxP / エピジェネティクス / 修飾塩基
Outline of Annual Research Achievements	ゲノム上の塩基修飾を含めたエピジェネティックな状態は近接する領域の状態により影響を受けることが知られている。その解析方法として修飾酵素をDNA領域に固定する間接法は存在するが直接的に特定の場所に修飾塩基を導入する方法は存在していない。ゲノム上の標的となる遺伝子の上流部分に、in vitroで塩基修飾を施したDNAカセットを直接的に導入する実験手法を開発するとともに、5-メチルシトシン等の修飾塩基が近接するエピゲノムの状況からどのように影響を受けるのか、逆に近接領域にどのような影響を与えるのかに関して次世代シーケンサーを用いて解析する手法を開発する。新規部位特異的組み換えシステムであるVCre/VloxPとSCre/SloxPの両サイトを使用したDual RMCE (組み換え酵素依存的なカセット交換)法を用いて効率的に外来の遺伝子や修飾されたDNAをゲノム上へ直接的に導入する。本年度はCFP1/CXXC1遺伝子の上流部分に修飾塩基を含むDNAカセットを導入するために作製した受け手側のHEK293細胞(Vlox-Puro-TK-Slox)に、NNNN配列(N12個）を含むDNAカセットをVCre/VloxPとSCre/SloxPのDual RMCE法で導入した。NNNN配列を含むオリゴを用いたPCRによりNeo遺伝子を含むDNA発現カセットを作製したが、導入後の細胞のゲノムDNAに挿入されたNNNN配列の分子バーコードを調べることにより、導入されたDNAカセット分子の１分子1分子を区別することが可能となることを次世代シーケンサー(MiSeq)を用いてシーケンスを行い、結果を解析することで検証した。修飾塩基の導入に伴うエピゲノムの変化を細胞１個１個ごとに明確に区別した詳細な解析を次世代シーケンサーを用いて行なうことができることが期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画通りに、Dual RMCE法でNNNN配列を持つDNAカセットを導入し、細胞のゲノムDNAを次世代シーケンサーで調べることによって、多種類のDNA分子を導入して、NNNNの配列により細胞を区別することが出来ることを示すことができた。
Strategy for Future Research Activity	当初の計画通りに次年度の計画を進めていく予定である。
Causes of Carryover	(理由）効率的に予算を執行することができた。また、古くなってしまった備品の買い替えを予定していたが、故障等の問題がなく継続して使用することが可能であったために次年度使用額が生じた。（使用計画）古くなってしまった備品の故障等の状況を考え合わせて、計画的に有効に使用する予定である。