2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of Reaction Mechanism of Bili Reductase by Multiple Methods Mainly Neutron Structure Analysis
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16K07261
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
海野 昌喜 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 教授 (10359549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森 聖治 茨城大学, 理工学研究科(理学野), 教授 (50332549)
久保 稔 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90392878)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 中性子結晶構造解析 / 結晶成長 / 光合成色素 / 酵素 / 水素原子 / プロトン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
フェレドキシン依存性ビリン還元酵素PcyAは、ビリベルジン（BV）を基質としたフィコシアノビリン（PCB）生合成反応を触媒する。この反応の特徴は、PcyAがBVの異なる二か所を一定の順序で特異的に還元するということである。その特異な還元反応機構を解明すべく、本研究の前の課題で野生型（WT）PcyA-BV複合体の中性子結晶構造解析が行われた。その結果、Asp105がプロトン化と脱プロトン化の2つのコンホメーションを持ち、同時にBVとBVH+の2つの状態が混在していると示唆された。しかし、2015年に発表した野生型（Wild Type; WT）のPcyA-BV複合体の中性子結晶構造解析の結果では、第一プロトンドナーと考えられているGlu76のプロトンの存在を確認することができなかった。そこで本研究では、中性子結晶構造解析でGlu76側鎖の水素原子が観測できなかった原因を探るため、分光学的手法やX線自由電子レーザー（XFEL）を相補的に使った多角的手法でGlu76はプロトン化していることを突き止めた。また、研究過程で見出した吸収スペクトルの異なるAsp105Asn（D105N）変異体とIle86Asp（I86D）変異体のBV複合体について中性子結晶構造解析を行い、BVのプロトン化と吸収スペクトルの相関を考察した。それぞれ2.0Å分解能の中性子結晶構造解析により、BVや周辺の変異部分の水素原子を可視化することに成功し、これらの変異体の反応と水素結合ネットワークの関係も明らかにすることができそうである。また、研究の過程でI86D変異体については、結晶化の工夫が必要であった。タンパク質の中性子結晶構造解析では、通常、X線結晶構造解析で用いるものよりも非常に大きな結晶を育成する必要がある。基質との複合体かやリザーバー溶液と混合する比率などを工夫して良質な大型結晶を得た。
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[Journal Article] Crystal Growth of a Bilin Reductase PcyA I86D Mutant-Substrate Complex for Neutron Crystallography2019
Author(s)
Igarashi, K., Hagiwara, Y., Sugishima M., Wada, K., Fukuyama, K., Ikeda, A., Yano, N., Kusaka, K., Ostermann, A., Unno, M.
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Journal Title
Crystal Growth and Design
Volume: 18
Pages: 5174, 5181
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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