2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of polarization-dependent fluorescence correlation spectroscopy for initial process analysis of protein aggregation
| Project/Area Number |
16K07312
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
山本 条太郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (20585088)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 蛍光相関分光法 / 並進拡散 / 回転拡散 / タンパク質凝集体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生細胞内におけるタンパク質凝集体形成の初期過程における体積変化を偏光蛍光相関分光法（Pol-FCS）によって実現することを目指した。
平成28年度では、Pol-FCSの時間分解能と検出感度の両方を向上させ、GFP多量体の生細胞内測定に成功した。平成29年度では、蛍光タンパク質で標識した凝集性タンパク質の測定を細胞内で行う系の確立と実証を行った。試料として黄色蛍光タンパク質（Venus）で標識したTDP43タンパク質をマウス神経芽細胞腫細胞に発現させる系を確立した。また、TDP43の生細胞中における凝集過程を解析するためには細胞を生かしたまま継時的にpol-FCS計測するため、可能な限り短時間かつ弱い励起光で測定を行うための条件決定を行った。
当該年度（平成30年度）では、確立した測定条件において、生細胞中のTDP43タンパク質のPol-FCS測定を行った。しかし、生細胞中の凝集体形成は個体差が非常に大きく、比較検討を行うことが困難であった。このことから、次に凝集体形成時の形状変化を模擬するため、Venusを2分子含みカルシウムイオンに応答して変形する蛍光タンパク質を12種類作成し、このタンパク質を生成した溶液に対してPol-FCS計測を行った。カルシウムイオン添加によってコンパクトな形状をとることで、回転拡散の緩和時間が短くなり、Pol-FCS計測における回転拡散成分の振幅が変化することが明らかになった。さらにこの振幅は2つのVenus分子の配向性によって変化し、凝集性タンパク質の凝集初期過程において、その大きさに加えて配向性をも定量評価する可能性を示すことができた。タンパク質の凝集体・封入体形成はアルツハイマー等の発症と関わりがあるとしられており、凝集過程を定量評価可能とするこの研究は、これらの病気のメカニズム解明に大きく寄与できると考えられる。
|
Research Products
(6 results)
