2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K07328
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
上村 慎治 中央大学, 理工学部, 教授 (90177585)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
箕浦 高子 中央大学, 理工学部, 准教授 (80300721)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 微小管安定化剤 / パクリタクセル / チューブリン分子構造 / X線繊維回折 / 流動配向法 / 高時間分解能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管は、細胞の分裂や形態維持、細胞内輸送などに関わる重要な細胞骨格の１つである。その構成単位となるタンパク質、チューブリンは、微小管内に取り込まれると、βチューブリン内のGTPが加水分解されGDPチューブリンとなる。この時に起こる分子変形や縦方向の結合力の変化が、プロトフィラメント間の結合力を変え、微小管全体の構造変化を引き起こし、間接的に微小管脱会合の引き金になると予測される。この微小管の構造上の安定性、熱ゆらぎや剛性などの特性、さらに、モータータンパク質やMAPsとの生化学的な相互作用は、細胞内の物理化学的な環境に大きく左右されると考えられ、その動態を探る研究を進めている。パクリタクセルは、子宮癌や乳癌の治療薬として使われている化学物質であるが、βチューブリンに結合し、微小管構造を安定化し、低温でも脱会合を起こしにくくさせる性質がある。分裂装置を安定化させることで増殖を続ける癌細胞の活動を抑制する抗ガン剤として治療に使われている。本研究では、高速化・高精度化したＸ線繊維回折法を用い、微小管の直径変化・縦方向チューブリン周期が、秒単位で起こり得るかと追究している。
実験では、解析の時間分解能を上げるために、より高輝度のＸ線を使用できるSPring-8 BL40XUを使用した。これまで繊維回折に使用してきたBL45XUと比較して、１万倍の強度であるが、本研究で開発した流動配向法を使用すれば、微小管へ与えるダメージは少なく30秒まで連続して観察可能であり、かつ、0.25秒間の照射でも解析可能な回折像が得られることもわかった。回折像を連続的に収集しつつ、途中で任意量の薬剤を加える手法も開発し、種々の溶液条件でパクリタクセル添加前後の構造変化を追跡できた。詳細な解析を進めているが、１秒以内にみられる急速な構造変化をパクリタクセルが引き起こすあたらしい事実も発見できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
微小管の構造変化が、パクリタクセル結合後、どのような時間経過で起こるかは、その作用機構を知る上での重要な知見となる。これまで凍結電子顕微鏡像観察での報告から、プロトフィラメント本数が数十秒程度の早い時間で起こることが報告されている。さらに、我々はＸ線繊維回折の解析から、この変化が30秒以内に完了していることも報告している。Ｘ線繊維回折は、水溶液条件下での動的な変 化を追跡できる点、微小管径やチューブリン周期の変動を0.001nmもの高い精度で計測できる点、多数（数100万本）の微小管の平均的な値を数0.2～10秒間程度の露光で決定できる点、温度変化や試薬添加の効果（前後比較）を調べることが容易な点で、非常に優れた手法である。本研究では、これまで当研究室で試行錯誤を重ね実用化してきた流動配向装置を用い、パクリタクセル添加直後の急速な 構造変化を調べる実験を実施した。
今回、我々の前の報告と同じように、パクリタクセル添加でチューブリン周期が約3%の伸長する点が再確認できた。この変化は非常に速く１秒以内で起こること、また、この変化は、他の化学的な条件（GTP加水分解、二価イオン存在下等）でも変化することがわかった。Ｘ線繊維回折法を用い、秒単位の構造変化を追跡できるようになった意義は大きい。現在、詳細な解析を進めつつあるが、同時に、より高速の構造変化の追跡を可能とする新しい流動配向手法の開発にも着手している
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の大きな成果は、微小管の構造変化が、１秒以内で起こることを発見できた点である。従来の微小管会合・脱会合のゆっくりとした反応の他に、秒単位で起こり得る構造変化、それが、おそらく微小管全体にわたって起こるという証拠を挙げられた点で成功してきた。今後は、以下の３点に焦点を絞って解析・研究を進める計画である。
１つ目は、回折信号をより高いS/N比で収集する点である。近年のＸ線検出器（直接検出器）の活用を試みたいと考えている。Pilatusなどのダイナミックレンジの高い検出器を用いることで、信号データの蓄積が容易となり、より高い精度の解析が可能になると期待している。２つ目は、試料の濃度・試料厚を増やし、より強い回折信号を得るための実験装置の改良である。これにより、より高速な構造変化の追跡が可能になると期待している。従来の流動配向装置とは異なる装置開発を試みる。３つ目は、解析手法の再検討である。秒単位の急速な微小管構造変化は、おそらくはプロトフィラメント数の再編なしに起こるものと考えられる。これを裏付けるプロトフィラメント数が一定と見なせる解析結果になると予測される。特に径方向（赤道反射）の回折振動の詳細な解析から、この仮説の是非を検討する。
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| Causes of Carryover |
海外機関との共同研究を2017年度に開始することとなったため、国内で使用する機器類とは別に海外での実験移用する部品類の調達が急遽必要になった。そのための2018年度予算を一部2017年度に支出する変更を行った。
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[Presentation] Conformational switching of microtubule and cooperative binding of kinesin‐1 as a base for polarized transport2017
Author(s)
Shima T, Morikawa M, Kaneshiro J, Kambara T, Kamimura S, Yagi T, Iwamoto H, Uemura S, Shigematsu H, Ichimura T, Watanabe TM, Nitta R, Okada Y & Hirokawa N
Organizer
ASCB（米国細胞生物学会） 2017/12/2-6 Philadelphia USA
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