2016 Fiscal Year Research-status Report
神経樹状突起mRNA輸送・局所的翻訳と記憶形成を繋ぐ分子メカニズムの解析
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16K07361
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| Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
椎名 伸之 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 准教授 (30332175)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | mRNA輸送 / 神経樹状突起 / RNA granule / RNG105 / Arf |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経樹状突起へのmRNA輸送・局所的翻訳を担う「RNA granule」は、学習・記憶の他、精神疾患や神経変性疾患にも関連することが示され、研究の重要性が増している。しかし、mRNA輸送・局所的翻訳と学習・記憶を繋ぐメカニズムの多くは未だ不明である。今年度は、RNA granuleの主要なRNA結合タンパク質RNG105に焦点を当て、これまでにRNG105のターゲット候補として見出されたmRNA（低分子量Gタンパク質Arfの制御因子をコードするmRNA 9種類）が、実際にRNG105と相互作用して樹状突起へ輸送されることを明らかにする研究に取り組んだ。
まず、成体の野生型マウスの大脳からRNG105抗体により免疫沈降を行い、定量的RT-PCRにより各ターゲットmRNAを定量した。その結果、いずれのターゲットmRNAもRNG105と結合することを明らかにした。
次に、各ターゲットmRNAの全長（5’ UTRから3’ UTRまで）をクローニングし、マウス大脳神経初代培養細胞にMS2-GFPシステムを用いて発現させた。各mRNAをGFPにより可視化することで、樹状突起への輸送を解析した。その結果、ターゲットmRNA群は野生型ニューロンの樹状突起へ輸送されることを明らかにした。また、樹状突起で検出されたターゲットmRNAのシグナルの一部がRNG105抗体染色の局在と一致した。さらに、RNG105 ノックアウトニューロンにおいて、ターゲットmRNAの樹状突起輸送が低下する傾向が見られた。以上の結果から、ターゲットmRNAはRNG105と結合し、樹状突起へ輸送されることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、研究計画のうち、1) RNG105とArf制御因子mRNAの結合、2) Arf制御因子mRNAの局在・樹状突起への輸送、の2項目についてほぼ計画通り解析を進め、新たな知見を得た。特に、Arf制御因子mRNAの樹状突起輸送にはRNG105が必要であるという、重要な結論に繋がる知見を得た。以上の点から、本研究は当初の研究計画通り順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Arf制御因子mRNAの樹状突起輸送・局所的翻訳、及びArf制御因子が関わると考えられるシナプス機能について、以下の3項目の解析を進める。
1) Arf制御因子mRNA群の輸送責任cis配列の同定：本研究の最終的な目標は、樹状突起への輸送を欠損したmRNAが、シナプス可塑性や学習・記憶に及ぼす影響を解析することである。そのために、mRNAの輸送責任cis配列を欠失した神経細胞やマウスを作出することが必須となる。そこで、各mRNAの部分長について、MS2-GFPを用いた神経初代培養細胞でのmRNA輸送を解析する。これにより、各mRNAの輸送責任cis配列を決定する。
2) Arf制御因子mRNA群のシナプス刺激依存的翻訳：蛍光色変換を用いた局所的翻訳活性化のイメージング（TRICK法など）を行うために、各mRNAを組み込んだプラスミドを構築する。これらプラスミドを神経初代培養細胞に発現し、シナプス刺激に応じて局所的翻訳が引き起こされることを明らかにする。野生型とRNG105 KOマウス由来の神経細胞間での比較を行う。
3) RNG105 KOによるAMPA受容体のシナプス後部膜表面移行制御：Arf制御因子が調節に関わると考えられる、AMPA受容体のシナプス後部膜表面移行について、RNG105のKOの効果を明らかにする。神経初代培養系を用い、AMPA受容体サブユニットの細胞外ドメイン認識抗体により、細胞膜表面AMPA受容体を検出する。さらに、pH感受性pHluorin-AMPA受容体サブユニット融合タンパク質を神経初代培養細胞に発現し、シナプス刺激後、pHluorinの蛍光タイムラプスイメージングによりAMPA受容体のエンドソーム－細胞膜間の移行を解析する。野生型とRNG105 KOマウス由来の神経細胞間での比較を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度は、神経初代培養に用いる血清の大部分を既存のものを使用したことが主な理由である。血清はロットチェックを経て適したものを一度にまとめて購入するため、次年度に持ち越す。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
遺伝子組み換え実験や神経初代培養に用いる試薬、プラスチック器具等の購入に用いる他、培養に用いる血清の新たなロットチェックと購入に使用する。また、神経初代培養に供するマウスの飼育及び系統維持に関わる動物施設使用料も必要であり、そのために使用する予定である。
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