2016 Fiscal Year Research-status Report
A new ovulation inducing factor of sea cucumber
| Project/Area Number |
16K07424
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
吉国 通庸 九州大学, 農学研究院, 教授 (50210662)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 比較内分泌 / 排卵 / 生理活性物質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、ナマコを材料とし、排卵を誘起する生理活性因子の解明を目的とする。同因子の精製に伴い同時に検出が可能となる卵成熟誘起因子の精製も目的とする。これら因子の組織含量は極めて微量であり、平成28年度は、同因子の精製材料となる卵巣培養液の収集を行う計画とした。春期に入手したマナマコは50匹以下と予定量に満たなかったことから、7月に北海道神恵内村より道産マナマコを50匹ほど追加購入した。ニセクロナマコは、沖縄県内の業者より空輸にて入手した。
精製の出発材料となる卵巣培養液は、卵巣を産卵誘発ホルモンと共に培養することで、産卵誘発ホルモンの刺激を受けた卵巣組織から培養液中に種々の成分が分泌されたものである。この中に、卵成熟誘起因子や排卵のみを誘発する因子（排卵開始因子）が検出される。マナマコの卵巣はクビフリンを用いて、ニセクロナマコの卵巣は神経抽出液を用いて刺激した。平成28年度には、マナマコ・ニセクロナマコの卵巣培養液をそれぞれ、40匹分、50匹分調製・冷凍保存した。
卵巣を小型剪刀で細切する事で、卵成熟・排卵が自律的に誘起されることがある。切断刺激による何らかの興奮が生じ、その結果としてクビフリン投与後と同様の変化が誘起されると考えられる。卵成熟・排卵が観察された場合には、その培養液中に卵成熟誘起因子や排卵開始因子の活性が検出されることが判った。しかし、クビフリンや神経抽出液を用いた場合との活性量の差は不明である。
マナマコの精巣の培養液中に、卵巣の場合と同様の排卵開始因子活性と卵成熟誘起因子活性を新たに検出した。高性能ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて卵巣培養液の活性成分と同じ位置に溶出されることから、精巣から新たに検出した活性成分は卵巣培養液中の活性成分と同じ物質である可能性が考えられる。平成29年度以降は、卵巣培養液と精巣培養液を、生殖腺培養液として同様に扱うこととする。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【生殖腺培養液の調製】マナマコ・ニセクロナマコの生殖腺培養液は、どちらも数十匹分程度と当初の予定を大きく下回っている。29年度は、充分な数のナマコの調達を行う必要がある。精巣培養液にも同様の活性が検出される事から、生殖腺培養液の調製量の増加が期待できる。
【活性因子の予備的精製】調製した生殖腺培養液の一部を用いて、排卵開始因子及び卵成熟誘起因子の精製の予備検討を開始した。生殖腺培養液をSepahdexG-10を用いた脱塩カラムで処理すると、卵成熟誘起活性は高分子画分に回収され、低分子画分にはどちらの活性も検出されなかった。同高分子画分を凍結乾燥で濃縮後、Superdex30によるゲル濾過クロマトグラフィーで分離した所、卵成熟誘起活性は分子量2100-3300領域に検出され、排卵開始活性は低分子塩の溶出位置の直後に検出された。これら二つの活性は、卵巣培養液試料にも精巣培養液試料にも検出され、それらのSuperdex30での溶出挙動は同一であった。Superdex30でのクロマトグラフィーには、SephadexG-10で脱塩された高分子量画分を使用していることから、Superdex30での低分子領域での排卵開始活性検出は、ゲルマトリックスとの何らかの相互作用により、当該活性のカラムからの溶出が遅れたものと考えられる。その為、排卵開始因子は無機塩のような低分子ではないと思われるが、その分子量を推定することは出来なかった。
Superdex30で得られた卵成熟誘起活性画分をRP-AqueousG-30(2x250mm)を用いた水-アセトニトリル溶媒による逆相HPLCで分析すると、卵成熟誘起活性はアセトニトリル25%程度で溶出されることから、比較的、極性の高い化合物であることが予想された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
【生殖腺培養液の調製】28年度においては、ナマコの入手上の問題から、予定した通りの卵巣培養液を収集できなかった。しかし、精巣培養液中にも同様の2種の生理活性が検出されたことから、29年度以降は、卵巣に加えて精巣からの活性成分の抽出も可能となる。これにより、精製材料となる生殖腺培養液の収集の遅れを取り戻すことが出来ると考えている。また、マナマコについては、春に産卵期を迎える北部九州に加え、7月に産卵期を迎える北海道神恵内地区からの入手が可能になったことで、材料の安定供給性が高まった。
【活性因子の精製】28年度には、生殖腺培養液をSephadexG-10による脱塩の後、Superdex30によるゲル濾過を行うことで、排卵開始因子と卵成熟誘起因子を分離できることが判った。卵成熟誘起活性成分は、推定分子量2100-3300で、逆相HPLCでの効果的な精製が可能な中程度の極性を持つことを確認した。排卵誘発活性成分の分子量は不明で、逆相HPLCでの挙動の検討もまだである。29年度では、生殖腺培養液を脱塩・除タンパク質操作の後、直ちに逆相クロマトグラフィーでの分離を行うこととする。この操作で、排卵開始活性がどのように溶出されるか不明であるが、Superdex30での遅延溶出の挙動から、低極性物質としての溶出挙動を示すと予想される。
また、卵成熟誘起活性と排卵開始活性が、マナマコとニセクロナマコにおいて相互に作用するか否かについて検討する。
|
