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2016 Fiscal Year Research-status Report

転写産物データベース・形質転換系を活用した円石藻石灰化カスケードの解明

Research Project

Project/Area Number 16K07427
Research InstitutionTokyo University of Pharmacy and Life Science

Principal Investigator

藤原 祥子  東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (30266895)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords石灰化 / ハプト藻 / 円石藻 / バイオミネラリゼーション / 転写産物データベース / 形質転換系
Outline of Annual Research Achievements

円石藻は、ハプト藻植物門に属す微細藻類で、細胞表面に精巧な形態の石灰化された鱗片(円石)をもつ。本研究では、その石灰化の分子機構の解明を目的としている。初年度である今年度は以下の結果を得た。1. RNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニング系を確立し、cDNA マクロアレイ解析・転写産物データベースを活用して得られた候補遺伝子のスクリーニングを開始した。具体的には、先ず、円石形成細胞特異的発現遺伝子の一つであるカーボニックアンヒドラーゼ(CA)遺伝子ConC1のds RNAをプロトプラストに導入したところ、コントロールと比較して、mRNA量の減少が確認されるとともに、偏光顕微鏡観察、フローサイトメトリーにより円石量の減少が認められた。このことから、CAの中でも円石形成細胞特異的に発現するConC1遺伝子産物が円石形成に関与することが示唆され、スクリーニング系の確立にも成功した。この系を用いて他の候補遺伝子ConC3, ConC7, ConC16についても調べたところ、ConC7, ConC16が円石形成に関与する可能性が示唆された。今後は、さらに他の候補遺伝子についてもスクリーニングを進めて行く予定である。2. ベースプレート上でのin vitro石灰化系の確立に成功し、酸性多糖(Ph-PS-1, -2, -3)のうちPh-PS-2が石灰化開始に重要な役割を果たしていることを実証した。具体的には、Ph-PS-2のみを残す処理(低pH脱灰後ウレア処理)をしたベースプレートや、Ph-PS-2のみを添加したベースプレート上でも、石灰化が起こることを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニング系の確立に成功し、スクリーニングを開始することができた。また、次年度以降必要となるin vitroでの機能解析に向け、ベースプレート上でのin vitro石灰化系を確立し、酸性多糖Ph-PS-2の役割を実証することができた。

Strategy for Future Research Activity

今年度の成果を基に、さらにRNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニングを進める。得られた円石形成遺伝子について、形質転換系や in vitro 石灰化系を駆使して、遺伝子産物の局在性やカスケードにおける機能を解析し、Pleurochrysisにおける円石形成カスケードの全容解明を試みる。
① Pleurochrysisの形質転換系を用いたin vivoでの機能解析:得られた遺伝子について、形質転換系を利用し、変異株への相補性試験、レポーター遺伝子を用いた局在性の検討、過剰発現株を用いたin vivoでの機能の推定を行なう。機能の推定には、円石のCa量、酸性多糖量の測定、走査型電顕による円石の形態の観察、超薄切片の透過型電顕観察による細胞内円石形成過程(ココリス小胞)の観察、シャドウイング・透過型電顕によるベースプレートの形態観察を行う。カーボニックアンヒドラーゼやCa2+, HCO3-などのイオン輸送体遺伝子の場合には、これまでの経験を活かし活性を測定する。
② 大腸菌発現系等を用いた機能推定:イオン輸送体に関しては、大腸菌、酵母、Xenopus oocyte、もしくはリポソームの系で、RIもしくは電極を用いて測定する。酸性多糖やベースプレート、ココリス小胞の合成・構築に関わる可能性のあるものについては、酵素活性・in vitro石灰化に及ぼす影響を解析する。
③ プロモーター解析:円石化で発現上昇する複数の遺伝子について、鍵となる共通の転写因子を想定し、5’上流域を検索する。遺伝子導入系を用いて、プロモーターレポーターアッセイ等を行い、遺伝子発現ネットワークの理解を進める。

Remarks

Pleurochrysis transcript sequence database

  • Research Products

    (6 results)

All 2016 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (2 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Pleurochrysome: a web database of Pleurochrysis transcripts and orthologs among heterogeneous algae.2016

    • Author(s)
      Yamamoto, N., Kudo, T., Fujiwara, S., Takatsuka, Y., Hirokawa, Y., Tsuzuki, M., Takano, T., Kobayashi, M., Suda, K., Asamizu, E., Yokoyama, K., Shibata, D., Tabata, S., Yano, K.
    • Journal Title

      Plant Cell Physiol.

      Volume: 57 Pages: e4

    • DOI

      10.1093/pcp/pcv195

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Profiling of lipid and glycogen accumulations under different growth conditions in the sulfothermophilic red alga Galdieria sulphuraria.2016

    • Author(s)
      Sakurai, T., Aoki, M., Ju, X., Ueda, T., Nakamura, Y., Fujiwara, S., Umemura, T., Tsuzuki, M., Minoda, A.
    • Journal Title

      Bioresour. Technol.

      Volume: 200 Pages: 861-866

    • DOI

      10.1016/j.biortech.2015.11.014

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Arsenic metabolism in cyanobacteria.2016

    • Author(s)
      (1)Miyashita, S., Murota, C., Kondo, K., Fujiwara S., Tsuzuki, M.
    • Journal Title

      Environ. Chem.

      Volume: 13 Pages: 577-589

    • DOI

      10.1071/EN15071

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 円石藻 Pleurochrysisの円石形成2016

    • Author(s)
      櫻田舜人, 鈴木道生, 小暮敏博, 藤原祥子, 都筑幹夫
    • Organizer
      第11回バイオミネラリゼーションワークショップ
    • Place of Presentation
      柏
    • Year and Date
      2016-11-11 – 2016-11-12
  • [Presentation] RNAi による円石藻 Pleurochrysisの円石形成関連遺伝子の探索2016

    • Author(s)
      浅川航輝, 藤原祥子, 遠藤博寿, 都筑幹夫
    • Organizer
      第11回バイオミネラリゼーションワークショップ
    • Place of Presentation
      柏
    • Year and Date
      2016-11-11 – 2016-11-12
  • [Remarks] Pleurochrysome

    • URL

      http://bioinf.mind.meiji.ac.jp/phapt/index.html

URL: 

Published: 2018-01-16  

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