2016 Fiscal Year Research-status Report
転写産物データベース・形質転換系を活用した円石藻石灰化カスケードの解明
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16K07427
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
藤原 祥子 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (30266895)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 石灰化 / ハプト藻 / 円石藻 / バイオミネラリゼーション / 転写産物データベース / 形質転換系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
円石藻は、ハプト藻植物門に属す微細藻類で、細胞表面に精巧な形態の石灰化された鱗片（円石）をもつ。本研究では、その石灰化の分子機構の解明を目的としている。初年度である今年度は以下の結果を得た。１. RNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニング系を確立し、cDNA マクロアレイ解析・転写産物データベースを活用して得られた候補遺伝子のスクリーニングを開始した。具体的には、先ず、円石形成細胞特異的発現遺伝子の一つであるカーボニックアンヒドラーゼ（CA）遺伝子ConC1のds RNAをプロトプラストに導入したところ、コントロールと比較して、mRNA量の減少が確認されるとともに、偏光顕微鏡観察、フローサイトメトリーにより円石量の減少が認められた。このことから、CAの中でも円石形成細胞特異的に発現するConC1遺伝子産物が円石形成に関与することが示唆され、スクリーニング系の確立にも成功した。この系を用いて他の候補遺伝子ConC3, ConC7, ConC16についても調べたところ、ConC7, ConC16が円石形成に関与する可能性が示唆された。今後は、さらに他の候補遺伝子についてもスクリーニングを進めて行く予定である。2. ベースプレート上でのin vitro石灰化系の確立に成功し、酸性多糖（Ph-PS-1, -2, -3）のうちPh-PS-2が石灰化開始に重要な役割を果たしていることを実証した。具体的には、Ph-PS-2のみを残す処理（低pH脱灰後ウレア処理）をしたベースプレートや、Ph-PS-2のみを添加したベースプレート上でも、石灰化が起こることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニング系の確立に成功し、スクリーニングを開始することができた。また、次年度以降必要となるin vitroでの機能解析に向け、ベースプレート上でのin vitro石灰化系を確立し、酸性多糖Ph-PS-2の役割を実証することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の成果を基に、さらにRNAi による円石形成関連遺伝子のスクリーニングを進める。得られた円石形成遺伝子について、形質転換系や in vitro 石灰化系を駆使して、遺伝子産物の局在性やカスケードにおける機能を解析し、Pleurochrysisにおける円石形成カスケードの全容解明を試みる。
① Pleurochrysisの形質転換系を用いたin vivoでの機能解析：得られた遺伝子について、形質転換系を利用し、変異株への相補性試験、レポーター遺伝子を用いた局在性の検討、過剰発現株を用いたin vivoでの機能の推定を行なう。機能の推定には、円石のCa量、酸性多糖量の測定、走査型電顕による円石の形態の観察、超薄切片の透過型電顕観察による細胞内円石形成過程（ココリス小胞）の観察、シャドウイング・透過型電顕によるベースプレートの形態観察を行う。カーボニックアンヒドラーゼやCa2+, HCO3-などのイオン輸送体遺伝子の場合には、これまでの経験を活かし活性を測定する。
② 大腸菌発現系等を用いた機能推定：イオン輸送体に関しては、大腸菌、酵母、Xenopus oocyte、もしくはリポソームの系で、RIもしくは電極を用いて測定する。酸性多糖やベースプレート、ココリス小胞の合成・構築に関わる可能性のあるものについては、酵素活性・in vitro石灰化に及ぼす影響を解析する。
③ プロモーター解析：円石化で発現上昇する複数の遺伝子について、鍵となる共通の転写因子を想定し、5’上流域を検索する。遺伝子導入系を用いて、プロモーターレポーターアッセイ等を行い、遺伝子発現ネットワークの理解を進める。
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| Remarks |
Pleurochrysis transcript sequence database
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Pleurochrysome: a web database of Pleurochrysis transcripts and orthologs among heterogeneous algae.2016
Author(s)
Yamamoto, N., Kudo, T., Fujiwara, S., Takatsuka, Y., Hirokawa, Y., Tsuzuki, M., Takano, T., Kobayashi, M., Suda, K., Asamizu, E., Yokoyama, K., Shibata, D., Tabata, S., Yano, K.
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Journal Title
Plant Cell Physiol.
Volume: 57
Pages: e4
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Profiling of lipid and glycogen accumulations under different growth conditions in the sulfothermophilic red alga Galdieria sulphuraria.2016
Author(s)
Sakurai, T., Aoki, M., Ju, X., Ueda, T., Nakamura, Y., Fujiwara, S., Umemura, T., Tsuzuki, M., Minoda, A.
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Journal Title
Bioresour. Technol.
Volume: 200
Pages: 861-866
DOI
Peer Reviewed
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