2018 Fiscal Year Research-status Report
転写産物データベース・形質転換系を活用した円石藻石灰化カスケードの解明
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16K07427
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
藤原 祥子 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (30266895)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 石灰化 / ハプト藻 / 円石藻 / バイオミネラリゼーション / 転写産物データベース / 形質転換系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
円石藻は、ハプト藻植物門に属す微細藻類で、細胞表面に精巧な形態の石灰化された鱗片（円石）をもつ。本研究では、その石灰化の分子機構の解明を目的としている。３年目である今年度は、円石藻Pleurochrysis haptonemoferaを用いて以下の結果を得た。１. 昨年度までに、円石の基板（ベースプレート）上のSDS・DTT可溶性タンパク質と酸性多糖Ph-PS-2が石灰化の開始に重要であることを、in vitro石灰化実験により明らかにしていたが、今年度はこのタンパク質の同定と全長cDNAのクローニングを行った。同定については、このタンパク質をトリプシン消化したものについてnano LC-MS/MS解析を行い、P. haptonemoferaのトランスクリプトームから予想されるアミノ酸配列に対してMascot searchを行ったところ、RNAi法によりスクリーニングされていた円石形成関連候補遺伝子の産物の１つに一致することが示唆された。そこで、RACE法により全長cDNAを増幅して塩基配列を決定し、現在遺伝子産物の機能を調べるために大腸菌での発現条件の検討を進めている。2. ゲノム解析：次世代シーケンサーにより、これまでに得られていたショートリードデータに加えロングリードデータを得た。そしてこれらのデータを複合させることにより、これまでのドラフトゲノムの向上を図った。現在アセンブリ評価を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitro実験で石灰化の開始に重要な役割を果たすことが示されていたタンパク質（Sakurada et al., 2019）を同定し、それがin vivoでも石灰化に関与していることをRNAi実験からも示すことができた。また、このタンパク質の局在性と機能の解明のため全長cDNAクローンの準備を進めることができた。ゲノム解析についても、ロングリードデータを取得しドラフトゲノムを向上させることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度同定されたタンパク質をコードする遺伝子や昨年度までにRNAiによりスクリーニングされていた遺伝子について、遺伝子産物の局在性やカスケードにおける機能を解析し、Pleurochrysisにおける円石形成カスケードの全容解明を試みる。
① Pleurochrysisの形質転換系を用いたin vivoでの機能解析：それぞれの遺伝子について、レポーター遺伝子を用いた局在性の検討、発現抑制株、過剰発現株を用いたin vivoでの機能の推定、変異株への相補性試験を行なう。機能の推定には、走査型電顕による円石の形態の観察、円石のCa量、酸性多糖量の測定、超薄切片の透過型電顕観察による細胞内円石形成過程（ココリス小胞）の観察、シャドウイング・透過型電顕によるベースプレートの形態観察を行う。カーボニックアンヒドラーゼやCa2+, HCO3-などのイオン輸送体遺伝子の場合には、これまでの経験を活かし活性を測定する。
② 大腸菌発現系等を用いた機能推定：イオン輸送体に関しては、大腸菌、酵母、Xenopus oocyte、もしくはリポソームの系で、RIもしくは電極を用いて測定する。酸性多糖やベースプレート、ココリス小胞の合成・構築に関わる可能性のあるものについては、酵素活性・in vitro石灰化に及ぼす影響を解析する。
①、②のうち、特に今年度同定されたタンパク質の遺伝子については、遺伝子産物の局在性の検討、in vitro石灰化における機能の解析から進める。その他の候補遺伝子産物についても、これらの解析とともに発現抑制形質転換体の走査型電顕観察から着手する。
③ ゲノム解析、プロモーター解析：得られたゲノムデータを基に、石灰化関連遺伝子のプロモーター解析を行い、遺伝子発現ネットワークの理解を進める。さらに、Pleurochrysisとは別の系統に属す円石藻Emilianiaのオルソログ遺伝子のデータと比較を行い、円石を形成しないハプト藻の情報も加味して円石形成機構における共通性と特殊性を明らかにする。
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