2017 Fiscal Year Research-status Report
担子菌のファミリー131に属する二種類のタンパク質の構造と機能の解明
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16K07687
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
殿塚 隆史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50285194)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | バイオマス / 担子菌 / 糖質加水分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖質加水分解酵素ファミリー131（GH131）に属する酵素は、セルロース系バイオマスによって発現が誘導することが知られているが、その機能はほとんど不明である。本研究では担子菌Coprinopsis cinerea由来GH131に属する2種類の酵素CcGHおよび関連酵素について、その構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成29年度は以下の研究を行った。
1. CcGH131Bについて、触媒残基と考えられるアミノ酸残基グルタミン酸161をアラニンに置換した酵素E161Aを結晶化しさまざまな糖とソーキングしてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、セロビオースの明瞭な電子密度がマイナス側のサブサイトに、緩衝液として使用したMES分子の電子密度がプラス側のサブサイトに観察された。リガンドとCcGH131Bとの相互作用を解析するため、セロビオースおよびMES分子より4Å以内に存在するアミノ酸残基を調べたところ、16もの残基があることが分かった。セロビオースはいくつかのアミノ酸残基と直接水素結合を形成していた。これに対してMES分子の周囲にある残基はロイシンやバリンなど疎水性のものが多く、水素結合はほとんど見られなかった。このことからプラス側のサブサイトは糖ではなく疎水性の分子を認識するものと考えられた。
2. 基質とどのように反応するか探索するため、フッ化セロビオシドを合成しフッ化物イオンの遊離を測定することとした。しかしながら、フッ化セロビオシドは分解しやすいため正確な測定が難しく、酵素による反応かどうか特定するには至らなかった。
3. 関連する酵素として、β-フルクトフラノシダーゼ、α-アミラーゼの構造を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに機能と構造が研究されているGH131タンパク質としては、本研究の材料であるC. cinerea由来の二つのタンパク質CcGH131AとCcGH131Bの他に、子嚢菌Podospora anserina由来のPaGluc131Aがあげられる。PaGluc131AはCcGH131Aと42%の相同性があるが、我々のこれまでの研究でCcGH131AにはPaGluc131Aに見られるような活性は観察されておらず、CcGH131Aの真の基質を明らかにするには至っていない。
本研究では、C. cinereaのもう一つのGH131タンパク質であるCcGH131Bに着目することで、GH131タンパク質の研究を進展させることを目指している。CcGH131Bについても真の基質を明らかにしたとは言えないので、飛躍的に進展しているとは言えないが、立体構造よりCcGH131Bは活性中心の溝がCcGH131Aより深いことが明らかになり、さらに変異酵素の解析によりサブサイトマイナス側ではセロビオースが結合すること、サブサイトプラス側では糖ではなく何らかの疎水性分子が結合することが明瞭に示された。これらのことから、CcGH131Bの基質探索はCcGH131Aと比較しかなり候補が絞られてきたと言えるため、標記の評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって、CcGH131BはCcGH131Aとは異なる基質特異性を持つことが分かった。次年度も引き続き基質の探索を行う。CcGH131Bは単糖のみで構成される物質ではなく、糖と疎水性領域から構成される分子に作用することが判明した。植物におけるこのような構成成分としては糖とモノリグノールで構成された物質が考えられる。実際に、このような糖と疎水性領域から構成されるさまざまな物質に対して作用するかどうか、クロマトグラフィーなどを用いて解析する。
また、フッ化セロビオシドについては取り扱いが難しく、その分解が酵素反応によるものかそれとも非酵素的な分解なのか区別することが難しかった。そこで、活性中心付近のアミノ酸残基に変異を導入し、作製した変異酵素に対する作用を見ることにより、詳細な解析を試みる。
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| Causes of Carryover |
平成29年度は予算計画に対して99.7%の執行と、2,257円の残額はあるもののほぼ計画どおりである。本研究は機能未知酵素の研究であり、解析を行った結果から機能を推定し、推定した機能を解析するための試薬を購入していくというような方法で研究を遂行しているため、試薬については当初の計画とは多少異なるものを購入する場合が発生するため使用額の差が生じた。未使用額については、平成30年度に試薬の購入のための物品費とすることを計画している。
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[Journal Article] Crystal structure of a β-fructofuranosidase with high transfructosylation activity from Aspergillus kawachii2017
Author(s)
Nagaya, M., Kimura, M., Gozu, Y., Sato, S., Hirano, K., Tochio, T., Nishikawa, A. and Tonozuka, T.
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Journal Title
Bioscience Biotechnology and Biochemistry
Volume: 81
Pages: 1786-1795
DOI
Peer Reviewed
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